小白菊內(nèi)酯對人肺癌A-549細胞周期變化和凋亡通路影響的實驗研究.pdf

1、目的：研究小白菊內(nèi)酯對人肺癌A-549細胞株的抗增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用及其機制，為研發(fā)新型抗腫瘤中藥奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　方法：應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)人肺癌 A-549細胞；應(yīng)用 MTT法測定小白菊內(nèi)酯對肺癌細胞的毒性作用和抑制增殖作用；應(yīng)用倒置顯微鏡、HE染色光學顯微鏡、吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）雙染色熒光顯微鏡及Annexin V-FITC/碘化丙錠(PI)染色熒光顯微鏡等觀察藥物作用前后人肺癌 A-549細胞的形態(tài)學

2、變化；應(yīng)用活性氧（ROS）檢測藥物作用后細胞內(nèi)活性氧的水平，以及活性氧含量與細胞凋亡之間的關(guān)系；應(yīng)用流式細胞術(shù)（FCM）檢測藥物作用之后腫瘤細胞周期分布以及誘導(dǎo)凋亡的情況；應(yīng)用免疫細胞化學技術(shù)檢測藥物作用前后蛋白陽性表達變化的情況并進一步探討小白菊內(nèi)酯對人肺癌 A-549細胞株抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機制。
　　結(jié)果：（1）MTT法結(jié)果顯示：小白菊內(nèi)酯在不同濃度對人肺癌A-549細胞有不同程度的生長抑制作用，并呈現(xiàn)出濃度和時間梯度

3、依賴性。（2）顯微鏡形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)實驗組細胞體積縮小、變圓，核染色質(zhì)聚集成團，細胞之間的連接疏松，貼壁不牢，易脫落。HE染色觀察到實驗組細胞體積變小，數(shù)目減少，可見部分細胞核固縮碎裂以及凋亡的細胞；AO/EB熒光雙染顯微鏡觀察：對照組細胞呈現(xiàn)綠色熒光，而實驗組中早期凋亡細胞呈現(xiàn)黃綠色熒光，隨著小白菊內(nèi)酯作用時間的延長，呈現(xiàn)橘紅色熒光的晚期凋亡細胞和壞死細胞；Annexin V-FITC/PI染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)實驗組細

4、胞可見大量綠色熒光細胞和紅色凋亡細胞。（3）活性氧檢測發(fā)現(xiàn)：實驗組細胞內(nèi)活性氧的水平出現(xiàn)明顯升高。（4）流式細胞術(shù)檢測結(jié)果觀察：G0/G1期細胞減少，而S期和G2/M期細胞數(shù)量明顯增多，說明人肺癌 A-549細胞株被阻滯于S期和G2/M期（P<0.05）。（5）免疫細胞化學檢測法結(jié)果顯示實驗組細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Fas和Bax的表達增加,而Bcl-2、Ki-67、Livin、Survivin和

5、NF-κB表達降低,與對照組相比有顯著差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.小白菊內(nèi)酯對人肺癌A-549細胞有明顯的抑制增殖作用,并且呈濃度和時間依賴性，其抑制增殖的作用機制可能與細胞周期發(fā)生S期和G2/M期阻滯有關(guān)。
　　2.小白菊內(nèi)酯作用于人肺癌A-549細胞株后,誘導(dǎo)其出現(xiàn)細胞凋亡的改變，它通過死亡受體通路和線粒體通路來完成誘導(dǎo)凋亡的機制，NF-κB有可能參與了小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)人肺癌A-549細胞凋亡的作用。