瘢痕疙瘩p53基因突變的實驗研究.pdf

1、目的:檢測瘢痕疙瘩組織及其成纖維細(xì)胞p53基因突變,進(jìn)一步研究野生型p53基因的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長和凋亡中的作用,以探討p53基因突變在瘢痕疙瘩形成和發(fā)展中的作用和意義.方法:第一部分:瘢痕疙瘩和正常產(chǎn)痕患者各12例共24人,取瘢痕疙瘩和正常瘢痕組織,并分別采用同一患者正常皮膚及血標(biāo)本作為對照,體外培養(yǎng)所取瘢痕組織和皮膚組織的成纖維細(xì)胞,采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法(PCR-SSCP)和基因測序,檢測各組織及相應(yīng)成纖維細(xì)

2、胞p53基因4-8外顯子的突變.第二部分:野生野p53基因重組腺病毒載體(Ad-p53)體外轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞,采用Northern Blot和Western Blot方法檢測外源性野生型p53基因的表達(dá).第三部分:野生型p53基因重組腺病毒載體(Ad-p53)體外轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞,采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),繪制細(xì)胞生長曲線,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及DNA梯度電泳檢測細(xì)胞的生長和凋亡.結(jié)果:第一部分:采用PCR-SSCP和基因

3、測序,檢測到9例瘢痕疙瘩組織及其成纖維細(xì)胞p53基因4-7外顯子的7種點突變和移碼突變.正常瘢痕組織,正常皮膚組織、相應(yīng)成纖維細(xì)胞和血標(biāo)本均本檢測到突變.第二部分:野生型p53基因重組腺病毒載體(Ad-p53)可高效地體外轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后1d外源基因出現(xiàn)表達(dá),3d達(dá)到峰值后逐漸下降.外源性p53mRNA和P53蛋白可在轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞有效表達(dá).第三部分:與未轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染野生型p53基因的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)