蚯蚓提取物干預矽塵誘導的小鼠肺纖維化研究.pdf

1、塵肺病是由于長期吸入生產性粉塵引起的以肺組織不可逆性進行性纖維化為主的全身性疾病。當前塵肺病仍是我國影響面最廣泛、最嚴重的職業(yè)病。我國每年新診斷職業(yè)病中85％以上為塵肺病，塵肺病中絕大多數屬于煤工塵肺和矽肺，占塵肺病的90％以上。煤工塵肺包括煤肺、矽肺和煤矽肺，其發(fā)病機制與矽肺基本相同，均與煤塵/矽塵中游離二氧化硅含量密切相關。目前大容量肺灌洗術對清除肺內粉塵很有效，適合早期病人，但是患者不易接受，難以推廣?；颊弑容^容易接受藥物治療，但

2、針對塵肺病肺纖維化的特效藥物很少。我國已經診斷的塵肺病人已超過70萬，而且每年新增1.5萬左右的新病例，這類疾病的治療是現階段亟待解決的問題。
　　蚯蚓也稱地龍，為常見的一種陸生環(huán)節(jié)動物，生活在土壤中。其體內含有豐富蛋白質、礦物質及脂肪酸。蚯蚓是我國重要的中藥材之一，最早的中藥學專著《神農本草經》中收載的67種動物藥中就有蚯蚓，用于治療多種疾病。1995年國家衛(wèi)生部批準了蚯蚓提取物的生產，在治療心腦血管疾病上得到了非常廣泛的應用。

3、蚯蚓提取物中主要的功效性成分為蚓激酶和纖溶酶。動物實驗和臨床觀察均證明，蚯蚓提取物有著很多藥理學功能，例如纖溶，抗凝，抗炎以及抗氧化等。理論上這些功能是能夠抑制矽塵誘導的肺部早期炎癥反應及后期的纖維化，目前未見相關報道。因此，我們構建矽塵誘導的肺纖維化動物模型，用蚯蚓提取物早期干預和治療矽肺，通過觀察病理學、肺纖維化標志物及μ CT等判定其干預和治療效果，為開發(fā)有效的預防/治療矽肺肺纖維化藥物提供科學依據，也為擴大蚯蚓提取物的治療領域提

4、供新的線索。
　　目的:通過建立矽塵誘導的小鼠肺纖維化模型，設立蚯蚓提取物預防、早期治療和纖維化成熟期治療三種實驗方案，來探討蚯蚓提取物是否能預防/治療矽塵誘導的肺纖維化，為開發(fā)有效的預防/治療矽肺病藥物提供科學依據。
　　方法:(1)設計蚯蚓提取物預防、早期治療和纖維化成熟期治療矽肺三種實驗方案;①預防方案:小鼠隨機分為4組，對照組、矽塵組、蚯蚓提取物低劑量組和高劑量組。高、低劑量組分別腹腔給予純化蚯蚓提取物（酶活性單位分

5、別為24U/g和240U/g），每天1次，共5天。然后經氣管一次性滴注SiO2粉塵懸液，第2天繼續(xù)腹腔給予蚯蚓提取物，對照組和矽塵組給予生理鹽水，連續(xù)給藥至不同時間終點（7天、14天、28天）;②纖維化早期治療方案:分組同前，另外加入吡非尼酮治療組。除對照組外，其余各組均行氣管一次性滴注SiO2粉塵懸液，對照組氣管滴注生理鹽水;第4周開始給藥治療，治療5周觀察療效。③纖維化成熟期治療方案:分組同前，矽塵處理第5周開始給藥治療，治療4周觀

6、察療效。(2)通過小鼠BALF細胞計數、病理切片HE染色、纖維化評分以及肺臟μCT來觀察SiO2粉塵誘導小鼠矽肺發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化過程;(3)通過Masson染色、免疫組化和WB等實驗技術檢測膠原纖維、α-SMA、E-cad、TGF-β1、Smad2等纖維化標志物的動態(tài)表達情況;應用ICP-MS檢測小鼠血清中硅含量變化趨勢。
　　結果:
　　1蚯蚓提取物預防矽塵誘導的小鼠肺纖維化
　　(1) BALF細胞計數:BALF

7、中細胞總數、巨噬細胞及中性粒細胞數量變化趨勢基本一致，矽塵能顯著增加肺泡內上述細胞數量，但隨著處理時間的增加細胞數呈下降趨勢，蚯蚓提取物在一定程度上能抑制矽塵導致的炎癥細胞滲出，其BALF中細胞數量高于對照組而低于矽塵組。矽塵處理初期，蚯蚓提取物能增加BALF中淋巴細胞的數量，以高劑量組BALF中淋巴細胞數量最多，隨時間逐漸降低，在28天淋巴細胞數量低于矽塵組，高于對照組。同樣說明蚯蚓提取物能抑制矽塵誘導的肺泡內炎癥細胞滲出。
　

8、　(2)病理切片HE染色顯示及纖維化評分:染塵后7天、14天、28天分別處理小鼠，與肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程較為典型的矽塵組相比，蚯蚓提取物處理組高、低劑量組變化趨勢基本一致，肺泡炎癥及肺纖維化程度均較模型組明顯減輕，干預7天組肺組織炎細胞浸潤區(qū)域較模型組明顯減少。干預14天組肺組織結構較模型組完整，成纖維細胞增殖減輕，細胞聚集范圍減小，病變程度較同期模型組輕。干預28天組雖出現細胞性結節(jié)，但大小及數量均較同期模型組少。纖維化評分從量化指標

9、上進一步證實了蚯蚓提取物能明顯抑制矽塵誘導的纖維化發(fā)生發(fā)展。
　　(3)μCT:處理28天后，矽塵組小鼠充氣肺容積立體像素值明顯低于對照組，高、低劑量蚯蚓提取物治療組小鼠充氣肺容積立體像素值略高于矽塵組，尤其是低劑量組與矽塵組比較有統(tǒng)計學意義。提示矽塵導致肺內含氣量減少可部分被蚯蚓提取物抑制。
　　(4)纖維化標志物:Masson染色顯示矽塵組膠原沉積明顯增多，高、低劑量蚯蚓提取物治療組膠原沉積較少;免疫組化結果顯示矽塵組的

10、α-SMA表達水平明顯增加，高、低劑量蚯蚓提取物處理組α-SMA表達水平明顯降低，接近對照組，而E-cad表達水平呈現相反的變化趨勢。纖維化信號通路(TGF-β)重要分子TGF-β1和Smad2在矽塵組表達明顯上調，而高、低劑量蚯蚓提取物處理組則明顯下調。提示蚯蚓提取物能夠抑制矽塵誘導的細胞外基質的沉積、成纖維細胞的活化及上皮細胞間質轉化，其機制可能是通過影響TGF-β信號通路實現的。
　　(5)血清硅含量:矽塵處理7天及14天后

11、，與對照組相比，矽塵組和高、低劑量蚯蚓提取物治療組血清硅含量均增加;至28天后，矽塵組和高、低劑量蚯蚓提取物治療組血清硅含量明顯增加，且高、低劑量蚯蚓提取物治療組血清硅含量顯著高于對照組。提示蚯蚓提取物能增加硅吸收入血，從而減少了肺內硅的含量。
　　2蚯蚓提取物治療矽塵誘導的小鼠肺纖維化
　　(1)纖維化早期治療效果:染塵后第4周開始治療，對照組10只小鼠均未發(fā)生纖維化性病變，矽塵組纖維化嚴重程度評分均數為3.0，分布范圍評

12、分均數為2.3;蚯蚓提取物治療組和吡非尼酮治療組病變嚴重性及分布范圍均明顯減輕，與矽塵組有統(tǒng)計學差異，提示蚯蚓提取物作為治療性用藥的效果良好。
　　(2)纖維化成熟期治療效果:染塵后第5周開始治療，對照組5只小鼠均未發(fā)生纖維化性病變，矽塵組纖維化嚴重程度評分均數為2.8，分布范圍評分均數為2.6;蚯蚓提取物治療后病變嚴重程度與矽塵組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），僅高劑量治療組病變分布范圍明顯較少，且有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）

13、，提示蚯蚓提取物治療效果主要是減少了纖維化病變分布范圍。μCT分析顯示與矽塵組相比，高低劑量組肺容積立體像素值增加，但無統(tǒng)計學差異，提示蚯蚓提取物治療成熟期肺纖維化時，能部分增加肺容積，但幅度有限。
　　結論:(1)小鼠肺纖維化的預防模型結果提示蚯蚓提取物在矽肺的發(fā)生發(fā)展的炎癥階段及纖維化階段均發(fā)揮抑制作用，且低劑量的給藥效果優(yōu)于高劑量給藥。(2)纖維化早期治療模型綜合來看，蚯蚓提取物和吡非尼酮均能有效抑制纖維化發(fā)展，且蚯蚓提取物