PDDV誘生內源性IFN-γ對小鼠血吸蟲病肝纖維化下調作用的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種世界性的主要公共衛(wèi)生疾病，流行于全球74個國家和地區(qū)，主要分布于亞洲、非洲和拉丁美洲。我國歷經半個多世紀的積極防治取得了巨大的成績，但是近年來，我國血吸蟲病有卷土重來之勢。目前全國共有血吸蟲病人67萬多人，主要是慢性和晚期血吸蟲病人(慢血和晚血)。慢血病人多發(fā)生肝纖維化繼而發(fā)展為晚血的肝硬化，治愈非常棘手。 血吸蟲病是一種免疫性疾病。血吸蟲不同蟲期釋放的抗原均能誘發(fā)宿主的免疫應答，尤以蟲卵引起的肝腸蟲卵肉芽腫最為嚴

2、重，并進而發(fā)生纖維化、甚至硬化，是慢血和晚血病人的主要病理表現(xiàn)。由此導致的肝脾腫大、門脈高壓和其他并發(fā)癥是晚血病人死亡的主要原因。肝纖維化的治療涉及祛除病因、抗氧化抗炎、調節(jié)肝臟膠原代謝、改善微循環(huán)及代謝障礙、減少并發(fā)癥(如門脈高壓等)等諸多環(huán)節(jié)，現(xiàn)今尚缺乏彳艮有效的抗纖維化藥物及方法。因此，探索阻遏肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的新途徑、新方法，不僅對血吸蟲病肝纖維化，而且對其他慢性肝病引起的肝纖維化的治療都極具價值。 本研究借鑒PDDV(

3、peptide-DNA dual vaccine)技術，將Th1型表位肽P4、P6、P18、P22分別與含相應編碼DNA和佐劑CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide)1826的重組質粒結合而制備混合多價疫苗PDDV，以期用混合PDDV免疫小鼠，上調其Th1型應答，誘導內源性IFN-γ產生，從而最終達到下調血吸蟲病肝纖維化的目的。 第一部分：進一步鑒定日本血吸蟲磷酸丙糖異構酶和副肌球蛋白的Th1型表位，為

4、構建復合多價疫苗奠定基礎。 磷酸丙糖異構酶(TPI)是WHO/TDR提出的針對曼氏血吸蟲(Sch&tosoma mansoni，Sm)的6個最具潛力的疫苗候選分子之一。Reynolds等發(fā)現(xiàn)重組的TPI(rTPI)在較強的Th2微環(huán)境下仍可誘導產生Th1型細胞因子，并從SmTPI序列中進一步篩選出了C57BL/6J小鼠特異的T細胞表位SmTPI-P18，以及CBA小鼠而非C57BL/6J小鼠特異性的T細胞表位SmTPI-P9。日

5、本血吸蟲中國大陸株的TPI(SjTPI)與SmTPI有84％的同源性，成蟲來源的TPI、重組rSjTPI以及SjTPI DNA疫苗等多種形式都顯示了較好的抗感染和一定的抗病理損傷作用。先前王新軍等根據(jù)Reynolds等報道的SmTPI-P18及SmTPI-P9，設計了SjTPI同源序列部分的相應表位SjTPI-P18及對照表位SjTPI-P9，并已鑒定SjTI-P18是C57BL/6J小鼠特異的T細胞表位。本研究中用重組rSjTPI-P

6、18T和合成SjTPI-P18刺激經重組rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞，檢測其細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平；再用高純度的合成表位肽SjTPI-P18刺激經sjTPI-P18加完全弗氏佐劑(CFA)免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細胞，檢測其細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平。 第二部分：借鑒PDDV技術，用篩選鑒定出的Th1型抗原表位P4、P6、P18、P22及Th1型免疫佐劑CpG OD

7、N1826，構建混合PDDV并進行免疫學鑒定。 PDDV是Wu YZ等首先在治療乙肝病毒的研究中構建的一個新的疫苗形式，借鑒基因治療方法中陽離子肽作為DNA的非病毒載體的技術，將表位肽疫苗和DNA疫苗結合構建的一種新的疫苗形式。本研究第一部分及本室先前工作已經從疫苗候選分子中共篩選鑒定了4個Th1型表位肽-P4、P6、P18、P22，還篩選出種屬特異性強、引發(fā)C57BL/6小鼠高Th1型應答的免疫佐劑CpG ODN1826。

8、 第三部分：混合抗原表位PDDV對血吸蟲感染小鼠肝纖維化下調-作用的研究肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展涉及多種復雜因素的刺激和調節(jié)，其根本原因是膠原的合成多于降解。主要的膠原生成細胞是肝星狀細胞(HSC)，而且纖維生成和溶解中基質重建的主要成分是基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶抑制因子(MMPs/TIMPs)，MMP-9/TIMP-1平衡起關鍵作用。眾多研究表明，Th2型細胞因子能夠下調MMP-9/TIMP-1表達的平衡致使ECM沉積增多，并通

9、過對HSC活化的調節(jié)等諸多關鍵環(huán)節(jié)促進肝纖維化發(fā)展。而以IFN-γ為主的Th1型細胞因子則能通過多種途徑抑制已活化的HSC，使其向靜息型轉變，并雙相調節(jié)MMP-9，主要對纖維化起下調作用。血吸蟲感染后形成蟲卵肉芽腫直至發(fā)生肝纖維化，存在著Th1型應答向Th2型應答漂移現(xiàn)象而使Th1/Th2平衡紊亂。因此通過上調Th1型應答恢復Th1/Th2平衡，上調MMP-9/TIMP-1平衡，從而抑制HSC活化，促使ECM的溶解和重建，對減輕肝纖維化

10、發(fā)展有著重要意義。 綜上，本研究觀察到混合表位-CpG PDDV免疫的血吸蟲慢性感染小鼠，其匯管區(qū)及蟲卵肉芽腫周圍纖維增生和炎性浸潤明顯減輕，肝纖維化程度減輕；肝臟細胞因子IL-4、IL-13、TGF-β mRNA水平顯著下降，IFN-γmRNA水平上升；肝臟的蛋白表達水平上，IFN-γ表達相應增高，MMP-9表達明顯增高，TIMP-1表達明顯下降；血清細胞因子和抗體檢測都顯示了Th1/Th2上調現(xiàn)象。并同時觀察到混合表位-Cp