miR-122a對(duì)肝癌細(xì)胞放療敏感性的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的
　　 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC，hepatocellular carcinoma)是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，我國(guó)是受肝癌威脅最大的國(guó)家，發(fā)病率和死亡率約占全球的50%[1]。大量研究表明，肝癌屬于放射中度敏感的腫瘤，其敏感性相當(dāng)于低分化鱗癌。近年隨著三維適形放療等技術(shù)的發(fā)展，逐漸克服了肝臟放射耐受量低的障礙，放療在肝癌治療中的作用也日益受到重視和肯定[2]。但肝癌放療療效遠(yuǎn)不盡人意，如何增加放射敏感性、有效

2、提高肝癌放療療效仍是目前亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸(nt)、非編碼的單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)約70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer酶加工后生成[3-4]，廣泛分布在病毒、植物、高等哺乳動(dòng)物中。通過(guò)與一種或多種mRNA部分序列堿基互補(bǔ)而在翻譯水平上調(diào)節(jié)這些靶基因的表達(dá)[5]。近年多項(xiàng)研究證實(shí)，miRNAs表達(dá)失調(diào)與

3、多種腫瘤相關(guān)，并且miRNAs具有腫瘤抑制基因或癌基因的功能[6-9]。不同的腫瘤具有不同miRNAs表達(dá)特征譜[10-16]，有研究表明miRNAs的差異表達(dá)與腫瘤放療敏感性密切相關(guān)[17-20]，但目前對(duì)miRNA的具體作用機(jī)制認(rèn)識(shí)有限，如具體分子機(jī)制能得以闡明，miRNAs聯(lián)合放療將成為一種非常具有潛力和臨床應(yīng)用價(jià)值的治療手段。
　　 miR-122a定位于人染色體的18q21.31，是肝臟特異性高表達(dá)miRNA，約占成年

4、個(gè)體肝臟總miRNAs的70%[21]，每個(gè)肝細(xì)胞表達(dá)量達(dá)66000拷貝以上，參與肝細(xì)胞分化、增殖、凋亡等眾多生物學(xué)過(guò)程，有研究發(fā)現(xiàn)miR-122a在70%肝癌組織和肝癌來(lái)源的細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)[22]，并證實(shí)miR-122a在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用[22-28]。在我們課題組的前期研究中，利用miRNA芯片技術(shù)篩選肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝上皮細(xì)胞LO2中miRNAs的差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中miR-122a呈低表達(dá)，

5、并且有研究表明miR-122a表達(dá)水平的改變可以使肝癌細(xì)胞株對(duì)化療藥物的敏感性發(fā)生變化[29]，而miR-122a與肝癌放療的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。因此本課題主要探索miR-122a的功能及其與肝癌細(xì)胞放療敏感性的關(guān)系。
　　 研究miRNA作用機(jī)制的關(guān)鍵是正確認(rèn)識(shí)miRNA及其靶基因的相互作用。我們利用miRNA靶標(biāo)基因數(shù)據(jù)庫(kù)miRGen3.0[30]對(duì)miR-122a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其靶基因進(jìn)行功能富集分析(GO-

6、Analysis)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(Pathway-Analysis)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，從而為尋找調(diào)控肝癌細(xì)胞放療敏感性相關(guān)的靶基因提供依據(jù)。
　　 為了進(jìn)一步研究miR-122a對(duì)肝癌細(xì)胞放療敏感性的作用以及分子機(jī)制，我們從預(yù)測(cè)的miR-122a靶基因中篩選出與放射敏感性密切相關(guān)的兩個(gè)分子cyclin G1和APE1進(jìn)行分析。cyclin G1是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞周期蛋白，在多種腫瘤中高表達(dá)，其基因啟動(dòng)子內(nèi)包括兩

7、個(gè)p53蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，是“p53-細(xì)胞周期”信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要效應(yīng)分子，其主要作用是調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期的轉(zhuǎn)換，參與了腫瘤的損傷修復(fù)，并與腫瘤細(xì)胞放療抵抗作用密切相關(guān)。目前有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)cyclin G1為miR-122a的靶基因，因此，miR-122a也可能通過(guò)作用于cyclin G1在調(diào)控肝癌細(xì)胞放射敏感性中發(fā)揮作用。APE1是DNA堿基切除修復(fù)途徑(BER)的關(guān)鍵限速酶，主要負(fù)責(zé)由電離輻射和基因毒性藥物如烷化劑引起的細(xì)胞核及線

8、粒體基因組DNA損傷，參與和調(diào)節(jié)眾多生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞凋亡以及腫瘤放療抵抗性[31]。本課題組前期已經(jīng)對(duì)APE1功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，確定APE1在腫瘤放療抵抗中發(fā)揮核心作用[32-33]，因此，驗(yàn)證miR-122a調(diào)控APE1表達(dá)是闡明miR-122a參與肝癌細(xì)胞放射敏感性作用的重要機(jī)制。本課題利用細(xì)胞周期分析、MTT、克隆形成分析、細(xì)胞凋亡等技術(shù)和方法分析miR-122a對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖與凋亡等生物學(xué)行為

9、的干預(yù)作用，并進(jìn)一步利用慢病毒轉(zhuǎn)染、蛋白表達(dá)等方法探討miR-122a和cyclin G1、APE1之間的作用及其與p53的關(guān)系，初步驗(yàn)證miR-122a參與調(diào)控肝癌細(xì)胞放療敏感性的作用及其可能分子機(jī)制，為揭示miR-122a在肝癌中韻生物學(xué)功能，解決臨床腫瘤患者的放療增敏作用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用不同的生物信息學(xué)方法對(duì)miR-122a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其靶基因進(jìn)行功能富集分析、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通

10、路富集分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。
　　 2.應(yīng)用miR-122a過(guò)表達(dá)慢病毒載體使不同p53表達(dá)狀態(tài)的肝癌細(xì)胞株中的miR-122a表達(dá)升高。
　　 3.利用細(xì)胞周期分析、MTT、克隆形成分析、細(xì)胞凋亡等技術(shù)和方法分析miR-122a對(duì)電離輻射前后的不同p53表達(dá)狀態(tài)的肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖與凋亡等生物學(xué)行為的影響。
　　 4.應(yīng)用Western blot法分析miR-122a與APE1、cyclin

11、G1蛋白表達(dá)的相關(guān)性。
　　 5.應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證APE1是否為miR-122a的直接作用靶基因。
　　 結(jié)果：
　　 1.目前預(yù)測(cè)miR-122a的靶基因有1104個(gè)，其靶基因涉及細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡等眾多生物學(xué)過(guò)程。
　　 2.miR-122a對(duì)Hep3B的細(xì)胞周期進(jìn)程有明顯的阻滯作用，而對(duì)HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程無(wú)明顯影響。
　　 3.miR-122a抑制

12、電離輻射后細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。
　　 4.肝癌細(xì)胞株中miR-122a的表達(dá)升高后，Hep3B細(xì)胞中的cyclin G1的表達(dá)明顯降低，而HepG2細(xì)胞中的cyclin G1的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 5.肝癌細(xì)胞株中miR-122a的表達(dá)升高后，APE1在Hep3B、HepG2細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-122a的靶基因涉及細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)