金雀異黃素對CIA大鼠關節(jié)FLS增殖、凋亡及其機制的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 研究金雀異黃素(genistein，Gen)對Ⅱ型膠原誘導型關節(jié)炎(collagen typeⅡinduced arthritis，CIA)大鼠關節(jié)成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。
　　 研究對象：
　　 CIA大鼠關節(jié)成纖維樣滑膜細胞
　　 方法：
　　 首先，采用Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑(com

2、plete Freund's adjuvant，CFA)共同建立CIA大鼠模型，對大鼠每周進行一次關節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評分及后肢容積測定。于造模第六周攝取關節(jié)X線片，然后處死大鼠，取大鼠后肢關節(jié)進行關節(jié)滑膜組織病理檢測，并取出關節(jié)滑膜組織，用膠原酶消化法分離培養(yǎng)原代FLS；采用臺盼藍拒染法檢測FLS活性，噻唑藍(MTT)法檢測Gen對FLS細胞增殖的影響，免疫印跡(Western Blot)檢測Gen作用C

3、IA大鼠關節(jié)FLS細胞后其凋亡蛋白bax和bcl-2的表達情況；Western Blot檢測MAPK和PI3K/AKT信號轉導通路中ERK、AKT和其磷酸化形式p-ERK、p-AKT蛋白的表達量。
　　 結果：
　　 1、Ⅱ型膠原致敏后三天，大鼠開始出現(xiàn)關節(jié)腫脹，AI評分逐漸增高，至造模后第三周最為明顯。通過觀察AI評分、后肢容積測定、關節(jié)X線片以及關節(jié)滑膜組織病理發(fā)現(xiàn)，造模組與空白對照組比較有顯著性差異。表明造模成功，

4、可滿足本實驗需要。原代培養(yǎng)CIA大鼠滑膜細胞，培養(yǎng)至第4代細胞形態(tài)均一。
　　 2、經(jīng)顯微鏡下細胞計數(shù)板計數(shù)臺盼藍染色FLS活細胞率大于90％，活性滿足實驗要求。MTT結果顯示，造模后CIA大鼠關節(jié)FLS增殖程度明顯高于正常組大鼠關節(jié)FLS，50、100和200μM的Gen均可以顯著抑制CIA大鼠關節(jié)FLS增殖，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，且在不同時間段均呈劑量依賴性抑制作用。200μM的Gen作用于CIA大鼠關節(jié)

5、FLS后，其增殖程度低于正常組FLS的增殖，其中，在72h時間段，兩組比較有顯著性差異(P＜0.05)。Western Blotting檢測凋亡蛋白水平結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠關節(jié)FLS細胞bax蛋白表達水平明顯降低，而模型組大鼠關節(jié)FLS細胞bcl-2蛋白表達水平較正常組大鼠關節(jié)FLS細胞明顯增高，均有顯著性差異(P＜0.05)；與模型組比較，不同濃度的Gen作用細胞后，隨著藥物濃度的增加，bax蛋白表達均有不同水平的上調，

6、其中Gen中劑量組(Gen2)和高劑量組(Gen3)與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，低劑量組(Gen1)與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)；用藥組bcl-2蛋白表達均有不同水平的下調，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 3、Western blot檢測MAPK和PI3K/AKT信號轉導通路中信號蛋白表達水平結果顯示：1)與正常組比較，模型組及用藥組EKR、AKT表達量均無明顯差異(P＞0.05)；

7、模型組FLS細胞p-ERK和p-AKT表達量高于正常組，且有顯著性差異(P＜0.05)；各Gen用藥組FLS細胞p-ERK蛋白的表達均低于正常組，有顯著性差異(P＜0.05)，且p-ERK表達的降低與Gen呈劑量依賴性。各Gen用藥組FLS細胞p-AKT蛋白的表達均高于正常組，Gen1和Gen2組與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05)，Gen3組與正常組p-AKT表達相當(P＞0.05)。2)與模型組FLS比較，各用藥組ERK、AKT

8、表達無明顯差異(P＞0.05)；不同濃度Gen用藥組FLS細胞p-ERK、p-AKT蛋白的表達均低于模型組，均有顯著性差異(P＜0.05)，且p-ERK、p-AKT表達的降低與Gen呈劑量依賴性。
　　 結論：
　　 1、本實驗CIA大鼠模型構建成功，并成功分離培養(yǎng)了原代大鼠關節(jié)FLS。
　　 2、Gen能夠抑制CIA大鼠關節(jié)FLS細胞的增殖，同時，可調節(jié)凋亡蛋白的表達，可能通過此機制促進CIA大鼠關節(jié)FLS的凋