糖基化修飾對抗腫瘤藥物生物活性影響的研究.pdf

1、隨著糖生物學的迅猛發(fā)展，以糖生物學研究為基礎的糖藥物，包括糖類、糖基化修飾的蛋白質，脂類和化學小分子藥物及其和酶相互作用的化合物，已成為新藥開發(fā)的重要領域。為了探討糖基化修飾對糖蛋白藥物和化學藥物生物活性的影響，本課題選用人重組干擾素β(rhIFNβ)、α-Gal(Galα1，3Gal)修飾的表皮生長因子受體HER2的單克隆抗體-α-Gal-Herceptin和新型NO供體半乳糖基化二醇二氮烯翁-β-Gal-NONO-ate作為研究對象

2、，探討糖基化修飾的藥物分子的作用機理和意義。為新藥品的設計和原有藥品的改造提供新的思路和理論依據；從而達到增加藥物的靶向性、有效地降低藥物的毒副作用、使藥物在體內表現為最佳活性狀態(tài)、降低藥物的用量和成本等目的。
　　 1.rhIFNβ在dhfr--CHO中的高效表達采用PCR技術從pLG104R載體中擴增目的基因，經XhoⅠ和SmaⅠ酶切后克隆到真核表達載體pCI-dhfr中；采用陽離子脂質體介導方法，將構建的表達載體轉染到dh

3、fr--CHO細胞中；通過氨甲喋呤(metlliomine sulphoximine，MTX)加壓篩選，以細胞病變抑制(cell pathological effect inhibition，CPEI)法定量檢測培養(yǎng)上清中表達產物的生物活性，將高效表達rhIFNβ的CHO細胞株擴大培養(yǎng)；經Blue Sepharose和CM Sepharose柱層析分離純化，以20％的聚乙二醇(PEG)6000透析濃縮、以夾心ELISA和Western-

4、blotting定量并鑒定表達產物。結果表明，成功地構建了rhIFNβ真核表達載體pCI-dhfr-ifnβ，確定了MTX的最佳篩選濃度為500 nmol·L-1，獲得了穩(wěn)定高效表達rhIFNβ的dhfr--CHO細胞株(9.3×105 IU/106cells·mL-1)，純化濃縮后所得產物的比活性為2.27×107IU·m-1。為填補我國無自主生產CHO細胞表達的rhIFNβ空白奠定了基礎。
　　 2.不同表達體系生產的rhI

5、FNIβ的生物活性比較采用CPEI和MTT法比較E.coli、Yeast和CHO細胞表達體系所生產的rhIFNβ的體外抗病毒和抗腫瘤活性；以人肺腺癌A549細胞接種的BALB/c裸鼠為實驗動物模型，通過瘤重的變化，比較三種不同來源的rhIFNβ對荷瘤小鼠的治療效果。結果表明，在100 ng·mL-1在濃度下，由CHO細胞表達的rhIFNβ，其體外抗病毒活性和抗增值活性顯著高于其他兩個表達體系；在E.coli、Yeast和CHO細胞表達體

6、系所生產的rhIFNβ對荷瘤小鼠的治療中，瘤重降低的比率分別是：16％、33.3％和50.6％。因此，rhIFNβ在動物體內的生物活性為：CHO細胞>Yeast>E.coli。結果提示，糖蛋白糖形結構越接近天然狀態(tài)，其生物活性就越高；同時，也顯示了以CHO細胞為生產平臺表達糖蛋白藥物的優(yōu)越性。
　　 3.半乳糖基化NO供體-β-Gal-NONOate的靶向胞內釋放及其對腫瘤細胞的抑制作用糖基化是改善化學藥物的水溶性、穩(wěn)定性、靶向

7、性及生物活性的有效手段。以具有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性C6/LacZ胞和無β-半乳糖苷酶活性的C6細胞為體外實驗模型，采用Griess法比較β-Gal-NONOate-與NONOate分別在C6/LacZ和C6細胞中NO的釋放量；通過細胞集落形成、臺盼藍拒染和MTT法比較β-Gal-NONOateNONOate對上述腫瘤細胞的毒性作用。結果表明，β-Gal-NONOate與C6/LacZ細胞中NO的釋放量呈劑

8、量依賴關系，并在相同藥物濃度條件下明顯高于NONOate(P<0.01)；然而，在不表達β-半乳糖苷酶的C6細胞中比較穩(wěn)定；β-Gat-NONOate對C6/LacZ細胞的毒性作用(IC50為5 mmol·L-1)明顯高于NONOate(IC50為10 mmol·L-1)(P<0.05)，但對C6細胞則沒有明顯的抑制作用；NONOate在C6/LacZ和C6細胞中的NO釋放量和對這兩個細胞系的作用效果都沒有顯著差異(P>0.05)。結果

9、提示，β-Gal-NONOate在癌細胞中釋放NO和對腫瘤細胞的毒性作用依賴于細胞對β-半乳糖苷酶的表達，因此對表達β-半乳糖苷酶的細胞具有靶向性；而NONOate對細胞是否表達β-半乳糖苷酶沒有選擇性。
　　 4.β-Gal-NONOate對人宮頸癌細胞凋亡的誘導效應的研究采用陽離子脂質體介導法，將真核表達載體pcDNA3-LacZ轉染到HeLa細胞中；經G418(400 mg·mL-1)篩選，以5-溴-4-氯-3-吲哚-D-

10、半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-Gal)法進行β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性檢測，獲得穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶的HeLa/LacZ細胞株；采用LDH法、DNA梯度電泳和形態(tài)學觀察檢測β-Gal-NONOate對HeLa/LacZ細胞凋亡的誘導效應；以MTT法比較β-Gal-NONOate和NONOate對HeLa/LacZ和HeLa細胞的

11、毒性作用。結果表明，β-Gal-NONOate可明顯誘導HeLa/LacZ細胞發(fā)生凋亡，在0-5 mmol·L-1濃度范圍內，呈劑量依賴關系；熒光顯微鏡觀察可見凋亡小體的形成，瓊脂糖凝膠電泳可見凋亡典型的DNA梯形條帶；MTT結果顯示，β-Gal-NONOate(5 mmol·L-1)對HeLa/LacZ細胞的毒性明顯高于NONOate(P<0.05)，而對未轉染LacZ基因的HeLa細胞的毒性作用與對照相比沒有明顯差異(P>0.05)

12、；NONOate對兩個細胞系的抑制效應沒有顯著差異(P>0.05)。結論β-Gal-NONOate可通過β-半乳糖苷酶的表達誘導HeLa/LacZ細胞的凋亡。
　　 5.α-Gal修飾的Herceptin增強人血清對乳腺癌細胞毒性作用的研究以過表達HER2的乳腺癌SK-BR-3細胞為體外實驗模型，采用流式細胞術檢測由α-Gal-Herceptin介導的anti-Gal與腫瘤細胞的結合率；采用細胞計數法、MTT法和LDH活性測定法

13、，比較α-Gal-Herceptin與Herceptin對SK-BR-3細胞的毒性作用。結果表明，人血清中的α-Gal抗體在α-Gal-Herceptin的引導下，能夠特異性地靶向SK-BR-3胞；當以人血清作為α-Gal抗體和補體來源時，α-Gal-Herceptin通過Herceptin對癌細胞表面HER2的識別，包被在SK-BR-3細胞表面，增強了癌細胞對人血清的敏感性，即α-Gal-Herceptin對SK-BR-3細胞的毒性作