病毒性軟化病病原（桐鄉(xiāng)株）的分離鑒定及ELISA檢測(cè)方法的初步應(yīng)用.pdf

1、家蠶病毒性軟化病是家蠶四種病毒病之一，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成非常嚴(yán)重?fù)p失的病害。日本學(xué)者Yamazaki等在1960年最早報(bào)道家蠶軟化病毒，其后該病毒在日本得到廣泛的研究。Ayuzawa(1972)首次應(yīng)用超速離心法從家蠶獲得該病的病原一家蠶病毒性軟化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus，BmIFV)。Kawase等(1980)研究表明該病毒(家蠶軟化病坂城株病毒)為細(xì)小核糖核酸病毒(picoma

2、virus)科病毒。Isawa等(1998)測(cè)定了坂城株BmIFV的全基因組序列，對(duì)核苷酸序列的比較(2C、3C和3D等)表明該病毒類似于哺乳動(dòng)物和植物的細(xì)小核糖核酸病毒，但對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化的推測(cè)研究表明該病毒與昆蟲(chóng)和植物的細(xì)小核糖核酸病毒有進(jìn)化關(guān)系，因此將其定為類似細(xì)小核糖核酸病毒。我國(guó)是世界上最大的養(yǎng)蠶國(guó)，即具有BmIFV最大的可寄生群體，但有關(guān)該病毒的分離研究、在我國(guó)蠶桑地區(qū)的流行狀況，以及危害程度等至今未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本文對(duì)從

3、中國(guó)浙江桐鄉(xiāng)蠶區(qū)分離的一株疑似家蠶病毒性軟化病病毒的非包含體病毒進(jìn)行了研究。 從浙江桐鄉(xiāng)收集的具有典型家蠶軟化病癥的病蠶，解剖取中腸，加磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)破碎勻漿。用氯仿抽提去除雜蛋白，40％硫酸銨(25℃)飽和度溶液鹽析，10700 r/min離心30 min(4℃)去除雜質(zhì)，蔗糖密度梯度超速離心(40％、30％、20％、10％的梯度，55000×g，2 h)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸收峰特征，電子顯微鏡下觀察，病毒為非

4、包涵體無(wú)囊膜，大小約為26nm的球形粒子。 從分離純化的病毒粒子提取病毒核酸，核酸的地衣酚反應(yīng)呈陽(yáng)性，二苯胺反應(yīng)為陰性。將病毒核酸分別用DNase I和RNase A降解，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析病毒核酸能為RNase降解，而不被DNase降解，實(shí)驗(yàn)表明病毒核酸為RNA。分離純化的病毒，經(jīng)12％的分離膠SDS電泳分析，可見(jiàn)該病毒有4個(gè)主要蛋白及3個(gè)次要蛋白條帶與已發(fā)表的BmIFV 相似，但未見(jiàn)VP4。 利用雜交瘤技術(shù)獲得了

5、2株分泌抗家蠶軟化病毒抗體的細(xì)胞株4E12、3G3，并對(duì)他們所分泌的單克隆抗體做了初步的鑒定。用辛酸一硫酸銨方法純化的單克隆抗體4E12和3G3的腹水蛋白質(zhì)濃度分別為：2.252 mg/ml和2.438mg/ml；抗體類型及亞類鑒定結(jié)果表明，4E12和3G3的抗體類型及亞類均為IgGl；2株單克隆抗體腹水的間接ELISA效價(jià)均達(dá)10<'-6>以上。FAS-ELISA測(cè)定表明，2株單抗僅對(duì)BmIFV有特異性反應(yīng)，而與家蠶濃核病毒(BmDN

6、V)無(wú)特異性反應(yīng)。用Western blotting對(duì)2株細(xì)胞分泌的單抗鑒定，表明它們的靶蛋白都是BmIFV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1(35kD)。利用制備的單抗建立了抗原包被的間接ELISA檢測(cè)BmIFV方法，對(duì)浙江省桐鄉(xiāng)蠶區(qū)的病蠶樣本檢測(cè)表明，該病在該區(qū)感染流行較為普遍。 本文首次從中國(guó)浙江省桐鄉(xiāng)市蠶區(qū)分離和初步鑒定了一株家蠶病毒性軟化病病毒(BmIFV-CHNool)，建立了基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法，并對(duì)該病毒引起的病害流行狀態(tài)作了初步