AT1受體抑制劑對(duì)雌激素作用下的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、無(wú)孕激素拮抗的高水平雌激素長(zhǎng)期刺激與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病關(guān)系密切,對(duì)于雌激素誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的機(jī)制研究更多圍繞其受體依賴(lài)作用,而對(duì)雌激素非受體依賴(lài)作用研究較少?，F(xiàn)有研究證實(shí)血管緊張素Ⅱ受體1(AT1-R)可以激活雌激素受體(-)的SKBR3乳腺癌細(xì)胞系中MAPK的活性,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖,所以我們推測(cè)雌激素是否能夠通過(guò)AR1-R促進(jìn)雌激素受體(ER)低表達(dá)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖。本研究從子宮內(nèi)膜癌發(fā)病中雌激素的非受體依賴(lài)機(jī)制這一新方向著手,探討雌激

2、素是否能夠通過(guò)AT1-R而不依賴(lài)于ER誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡抑制,從全新角度研究雌激素在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)制,同時(shí)找到拮抗這種分子機(jī)制的方法,渴望能通過(guò)控制雌激素非受體依賴(lài)性作用,最終抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展,為ER低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法,MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)及免疫印跡研究子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞中AT1-R、PI3K、p-Akt、ER

3、K蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性,探討雌激素(E2)及AT1-R抑制劑saralasin對(duì)HEC-1A細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 材料與方法：
　　 1、主要材料與儀器
　　 HEC-1A細(xì)胞株；胎牛血清；McCoy’s 5a培養(yǎng)基；水溶性17β-雌激素；AT1-R抑制劑saralasin和雌激素受體抑制劑ICI182780;兔抗人AT1-R抗體、PI3K抗體、p-Akt抗體及ERK抗體;山羊抗兔FITC熒光

4、標(biāo)記二抗；碘化丙啶(PI)；AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG；超凈工作臺(tái)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱;倒置相差顯微鏡；激光共聚焦顯微鏡觀察；分光光度計(jì)；流式細(xì)胞儀;超速低溫離心機(jī)；電泳儀；轉(zhuǎn)印槽；自動(dòng)凝膠成像分析儀
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法
　　 將HEC-1A細(xì)胞置于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的McCoy’s 5a培養(yǎng)液中,于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),

5、使其貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿95％以上后用0.25％胰酶進(jìn)行消化傳代。
　　 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)AT1-R、PI3K、p-Akt、ERK蛋白在HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)；應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)雌激素作用于HEC-1A細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的變化,以及saralasin對(duì)雌激素誘導(dǎo)下的HEC-1A細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響；Western blot分析雌激素作用后HEC-1A細(xì)胞中的ERK、p-Akt蛋白

6、表達(dá)的變化,及saralasin對(duì)雌激素誘導(dǎo)下的HEC-1A細(xì)胞中ERK、p-Akt蛋白表達(dá)的影響。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,應(yīng)用方差分析,LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,數(shù)據(jù)以(x)±s表示,取P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、AT1-R、PI3K、p-Akt及ERK蛋白在HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)
　　 激光共聚焦顯微鏡觀察AT1

7、-R、PI3K、ERK、p-Akt蛋白在HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AT1-R、PI3K、ERK蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),p-Akt蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)。
　　 2、雌激素及saralasin對(duì)HEC-1A細(xì)胞增殖的影響
　　 MTT結(jié)果提示在藥物作用5min、10min、15min時(shí)E2對(duì)HEC-1A細(xì)胞具有促增殖作用；在藥物作用10min時(shí),saralasin對(duì)HEC-1A細(xì)胞有明顯的抑制作用；在藥物作用各

8、時(shí)間段內(nèi),ICI182780對(duì)HEC-1A細(xì)胞均無(wú)明顯的抑制作用。
　　 3、雌激素及saralasin對(duì)HEC-1A細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素作用10min后HEC-1A細(xì)胞的G0～G1期細(xì)胞比例下降,S期的比例升高；saralasin作用于雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細(xì)胞10min后,其G0～G1期細(xì)胞的比例升高,S期細(xì)胞的比例相對(duì)下降,同時(shí)促使HEC-1A細(xì)胞發(fā)生凋亡,以晚期凋亡為主；而

9、ICI182780作用于雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細(xì)胞10min后,對(duì)HEC-1A細(xì)胞的細(xì)胞周期及促凋亡作用不明顯。
　　 4、雌激素及sarallasin對(duì)HEC-1A細(xì)胞中ERK、p-Akt蛋白表達(dá)的影響
　　 Western blot結(jié)果提示雌激素處理10min后,HEC-1A細(xì)胞中ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)；Saralasin作用10min后可使雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細(xì)胞中ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)；而I

10、CI182780作用HEC-1A細(xì)胞10min后ERK1/2蛋白的表達(dá)下調(diào)不明顯。各處理因素作用后HEC-1A細(xì)胞中p-Akt蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、雌激素對(duì)HEC-1A細(xì)胞具有促增殖作用,而雌激素受體抑制劑ICI182780對(duì)雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯作用,提示雌激素對(duì)HEC-1A細(xì)胞的促增殖作用是ER非依賴(lài)性的。
　　 2、AT1-R在HEC-1A細(xì)

11、胞中高表達(dá),抑制AT1-R后,HEC-1A細(xì)胞增值率明顯下降,凋亡率增加,細(xì)胞周期停滯在G0～G1期,ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),所以我們推測(cè)雌激素可能通過(guò)AT1-R促進(jìn)HEC-1A細(xì)胞增殖,其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 3、ICI182780對(duì)ER低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A無(wú)明顯的抑制作用,而AT1-R抑制劑Saralasin對(duì)HEC-1A細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,對(duì)于雌激素受體低表