幽門螺桿菌CagT及CagM蛋白的生物學性質及功能研究.pdf

1、幽門螺桿菌是一種微需氧螺旋狀的人類病原菌,世界上約一半人口的胃部都有這種細菌定植。幽門螺桿菌的感染通常發(fā)生在兒童時期,若不使用相應的抗生素治療則會伴隨至人終老而不能清除。這種細菌不僅能在人的胃內定植多年,甚至在歷史的長河中與人類相伴了一個相當長的時期?；蚍治霰砻?幽門螺桿菌在約58000年前隨著人類從東非遷往世界各地并與人類共同進化,且越來越適應人類的胃內環(huán)境,給人類造成嚴重的胃部和十二指腸疾病,甚至胃癌?；诖?1994年世界衛(wèi)生組

2、織宣布幽門螺桿菌為Ⅰ類致癌因子。
　　 幽門螺桿菌中長約40 kb的DNA編碼的致病島-毒素相關基因致病島(cytotoxin-associated gene pathogenicity island,cag PAI)是一種Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣ secretion system,T4SS),通常由28～30個基因組成。它通過將唯一的效應分子CagA轉運至胃上皮細胞,發(fā)生磷酸化,激活細胞內的相關信號通路,引起細胞的增殖、分化和

3、細胞延長,形成所謂的“蜂鳥”表型和介導IL-8的分泌來發(fā)揮生物學效應。
　　 基于cag PAI在幽門螺桿菌致病中的重要作用,國內外學者針對cag PAI開展了一系列研究。CagT基因是cag PAI中的一個關鍵基因,在由cag PAI引起的宿主病理損傷中扮演一個重要角色。cagT基因敲除菌株能阻斷CagA分子轉運至宿主細胞,進而阻斷宿主細胞“蜂鳥”表型的形成和IL-8的分泌。CagT(HP0532)是cag PAI中的一個蛋白

4、,也是cag PAI的結構基礎,與CagY蛋白一起構成了cag PAI的構框架。CagM(HP0537)是cag PAI的一個重要功能蛋白,cagM基因敲除菌株能夠阻斷CagA轉運至宿主細胞和宿主細胞的IL-8分泌。但目前關于cagT和cagM基因的研究還較少,它們在cag PAI致病中的作用機理研究尚在初始階段。本研究在前人研究的基礎上,進一步探討了CagT和CagM蛋白的生物學性質以及在幽門螺桿菌引起宿主病理損傷和疾病中的作用。

5、r>　　 1.CagT、CaM及CagA蛋白的表達、純化及免疫學性質研究提取26695菌株的基因組,采用PCR技術擴增去掉信號肽的cagM和cagT基因,cagA基因的部分片段,并將擴增的三個片段純化后采用T/A法克隆至pMD19-T載體。用相應的限制性內切酶切下目的片段,根據(jù)目的片段攜帶的酶切位點,將cagM基因與pQE30載體連接,轉化入宿主細胞E.coli M15；將cagT基因和caga基因片段分別與pET-28a(+)和pE

6、T-30a(+)載體連接,轉化入宿主細胞E.coli BL21(DE3)。用1mmol/L IPTG誘導三個重組菌中的目的蛋白表達,重組的CagM、CagT和CagA蛋白均可以可溶和包涵體兩種表達形式表達。包涵體洗滌液洗滌CagM和CagA包涵體重組蛋白。采用親和層析純化經(jīng)過洗滌的CagM和CagA包涵體蛋白和CagT可溶蛋白。純化后的三個蛋白各自免疫家兔制備各自的多克隆抗體。ELISA和Western blotting試驗證明三個重組

7、蛋白具有良好的免疫反應性。
　　 2.幽門螺桿菌cagT,cagM與cagA基因缺失菌株的構建與鑒定將含有氯霉素基因(Cam)的質粒pHe12和pBluescript SK(-)自殺質粒用SmaⅠ和XbaⅠ酶切后,Cam和pBluescript SK(-)連接。以26695菌株基因組為模板分別擴增cagM,cagT與cagA基因的上下游片段,克隆至pMD19-T載體,三個基因的上游片段用SacⅡ+XbaⅠ酶切后插入含Cam基因的

8、pBluescript SK(-)質粒,下游片段用ApaⅠ+SalⅠ酶切后插入含上游片段和Cam基因的pBluescript SK(-)質粒,分別構建cagM,cagT與cagA基因敲除菌株自殺質粒。三個基因敲除自殺質粒電擊轉化入26695菌株感受態(tài)細胞,在含有25μg/ml氯霉素抗性的平板上篩選敲除菌株。最后用PCR和Western blotting鑒定相應的敲除菌株。三個基因敲除菌株分別命名為△cagT、△cagM和△cagA。這些

9、基因敲除菌株的成功構建為研究CagT和CagM如何在幽門螺桿菌cag PAI轉運CagA蛋白進入宿主細胞發(fā)揮生物學效應提供了良好的研究工具。
　　 3.CagT和CaM蛋白對CagA轉運和磷酸化的影響及宿主細胞分泌IL-8的影響搖瓶培養(yǎng)幽門螺桿菌26695菌株、11637菌株、△caga菌株、△cagM菌株和△cagT菌株,待菌液濃度達到OD為0.5-1.0時,感染AGS細胞,感染復數(shù)為200,檢測不同菌株感染后AGS細胞的形態(tài)

10、變化、CagA蛋白轉運及磷酸化情況和IL-8的分泌。結果顯示,26695和11637野生株感染AGS細胞后,AGS細胞在形態(tài)上呈現(xiàn)“蜂鳥”表型,CagA蛋白轉運至AGS細胞內發(fā)生磷酸化,細胞培養(yǎng)上清中有大量IL-8分泌。△cagT菌株和△cagM菌株感染AGS細胞后,AGS細胞在形態(tài)沒有明顯變化,CagA蛋白也不能轉運至AGS細胞,這與△cagA感染后的結果相同,細胞培養(yǎng)上清中IL-8分泌與陰性對照沒有顯著差異:與之相反,△cagA感染

11、細胞的IL-8分泌與野生株相近。由此證明,CagM和CagT蛋白均是cagPAIⅣ型分泌系統(tǒng)中對CagA轉運至宿主細胞起關鍵作用的蛋白,且與宿主細胞IL-8的分泌密切相關。
　　 4.cagT和CagM蛋白的生物學性質和部分生物學功能研究本部分主要研究了CagT和CagM蛋白的生物學性質和部分生物學功能。首先檢測了CagT和CagM蛋白在攜帶完整cagPAI的幽門螺桿菌野生株中是否發(fā)生分子修飾和分子大小變化,幽門螺桿菌野生株破菌

12、后利用Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),CagT和CagM蛋白在幽門螺桿菌野生株中不發(fā)生分子修飾。利用不同的去污劑溶解,超速離心分級分離細菌的菌體蛋白,鑒定CagT和CagM蛋白在細胞膜的定位,結合生物信息學預測,證明CagT和CagM蛋白均位于細菌細胞的內膜和外膜部位。鑒于效應蛋白CapA位于細胞內膜,進一步檢測了它與CagT和CagM蛋白之間的相互作用,免疫共沉淀試驗的結果表明,CagA和CagT之間存在相互作用,而與Cag

13、M不存在相互作用。本試驗還用免疫沉淀試驗檢測CagT和CagM蛋白是否存在于胞外,Western blotting的結果表明,這兩個蛋白均不能分泌至胞外,它們功能的發(fā)揮只能依賴于錨定在細胞膜上。最后,Western blotting試驗證明cagM基因敲除菌株不會影響CagT蛋白的表達。
　　 通過上述研究表明,CagT蛋白在幽門螺桿菌T4SS轉運CagA進入宿主細胞發(fā)揮生物學效應的過程中既作為構成cagPAI不可或缺的一個結構