丙型肝炎病毒F蛋白抗原性、抗凋亡作用及細胞內磷酸化研究.pdf

1、本文對丙型肝炎病毒F蛋白抗原性、抗凋亡作用及細胞內磷酸化進行了研究。主要內容如下： 一、根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性原則設計了11條引物，應用引物延伸法合成了HCV f基因，以此為模板經(jīng)PCR擴增得到截短型f65基因片段(219bp)。將f65基因片段定向克隆至pET32a(+)，得到pET32a-f65重組子，然后將重組子轉化大腸桿菌Plyss菌株，經(jīng)IPTG誘導后獲得分子量約32kDa的HCV F65蛋白。 二、應用35

2、0μg/ml G418篩選得到穩(wěn)定表達F蛋白的HepG2細胞，以轉染空載體pcDNA3.1<'+>的HepG2細胞(Hep-3.1)為對照。WB檢測顯示，第1代和第10代Hep-f細胞均能表達14kDa左右的F蛋白。應用MTT法分別測定Hep-f和Hep-3.1細胞生長情況，結果顯示Hep-3.1細胞生長速度落后于Hep-f細胞生長速度(p<0.01)，說明HCV f基因促進HepG2細胞增殖。分別采用20、40、60、100和200U

3、/ml TNF-α處理Hep-f和Hep-3.1細胞，然后應用MTT法測定細胞生長情況，結果表明，20～200U/ml TNF-α對Hep-f和Hep-3.1細胞的生長抑制率分別為4.8～19.4％和8.3～53.1％，前者低于后者(p<0.05)，提示Hep-f細胞對TNF-α具有一定的抵抗作用。 三、應用引物延伸法獲得突變型HCV f基因，該基因第13、14、114、121和124位密碼子由野生型f基因的TCT突變?yōu)镚AT，