人骨骼肌成肌細胞的分離培養(yǎng).pdf

1、由于心肌細胞是終末分化細胞，不能再生，而且心臟內沒有心肌干細胞，因此心肌細胞損傷后只能通過瘢痕組織來修復，大量有收縮功能的細胞流失必然造成心室重構和心功能降低，最后導致患者終末期心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)，死亡。目前治療心衰的方法很多，包括藥物、PTCA支架置入術和冠狀動脈旁路移植術(CABG)、心臟移植及基因治療等，可通過降低心肌耗氧量、增加心肌血供、增強心肌收縮力及減輕心室重構等方法一定程度上延長患者

2、生存期，但均不能從根本上解決心肌丟失的問題，不能逆轉心室重構，使治療效果受到限制。近年來，利用細胞移植的方法重塑壞死區(qū)的心肌結構受到廣泛的關注，但由于供體的匱乏和異體移植帶來的排斥反應，使胚胎心肌細胞、胚胎干細胞或成體干/祖細胞受到很大限制。而骨骼肌成肌細胞可自體移植，不受供體來源限制，不需免疫抑制，故備受關注。本實驗旨在探索高效的人骨骼肌成肌細胞分離培養(yǎng)方法，為臨床應用自體成肌細胞移植治療心衰打下良好基礎。 方法：1.采用組織

3、塊反復貼壁法原代培養(yǎng)人骨骼肌成肌細胞，觀察成肌細胞生長的形態(tài)學變化；2.利用骨骼肌特異性標記物肌動蛋白(Actin)及結蛋白(desmin)對培養(yǎng)細胞進行免疫組化鑒定；3.將原代培養(yǎng)的成肌細胞多次傳代，同時對原代及傳代培養(yǎng)的成肌細胞計數(shù)，繪制其生長曲線，觀察成肌細胞增殖分化特性；4.探索成肌細胞凍存及復蘇的方法。 結果：1.形態(tài)學觀察：采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，肌組織塊接種于培養(yǎng)瓶5天后可見長梭形、紡錘形單核成肌細胞緩慢向組織塊外生

4、長，第6天后單核雙極性成肌細胞向組織塊外大量擴展呈鋪開狀放射樣分布，生長迅速，遠離組織塊區(qū)域的成肌細胞可呈典型的克隆樣生長和簇狀分布，表現(xiàn)出很強的分裂增殖生長特性。8-10天后，大量增殖的成肌細胞相互融合，形成核位于中央的多核性長管狀初生肌管。因此上述原代培養(yǎng)的肌細胞成肌過程大致分為緩慢生長期、分裂增殖期及肌管形成期3個不同的生長增殖分化期，時間分別為培養(yǎng)的第1-5天、6-8天、8-10天。在保持適宜的細胞密度和細胞培養(yǎng)條件下，組織塊至

5、少可以反復貼壁12次，而細胞形態(tài)保持不變。2.免疫組織化學鑒定：骨骼肌特異性標記物肌動蛋白(Actin)和結蛋白(desmin)免疫組化鑒定為陽性，證實了培養(yǎng)細胞的骨骼肌來源。3.骨骼肌成肌細胞增殖分化特性：采用組織塊反復貼壁培養(yǎng)法，肌組織塊貼壁后5天即開始有細胞從組織塊邊緣爬出，6-8天時生長旺盛，10天時長滿瓶底，可達1.6×104/cm2；原代培養(yǎng)細胞共貼壁12次，隨著貼壁次數(shù)增多，細胞爬出的速度增快，約在第10次時最快，3天即可

6、見有細胞爬出。原代培養(yǎng)的細胞至少可以傳代20次以上，在第10-15代時細胞增殖最為迅速，細胞倍增時間為24小時。4.凍存與復蘇：成肌細胞凍存、復蘇后生長良好，仍可保持原有形態(tài)及增殖分化特性。 結論：與酶消化法相比，組織塊貼壁法簡便、可行，耗材少，時間短、成本低。該方法實用性強，可在短時間內得到大量的高純度的成肌細胞，是原代培養(yǎng)人骨骼肌成肌細胞的較好方法。同時，可通過適當?shù)膬龃婕皬吞K方法使培養(yǎng)細胞得以長時間保存，為適時臨床細胞移植