人表皮細胞去分化的實驗研究.pdf

1、實驗目的： 皮膚是人體最大的器官，位于體表，易于受傷，在創(chuàng)傷愈合過程中，表皮細胞進行增殖、游走、覆蓋創(chuàng)面、分化從而完成創(chuàng)面的修復。表皮細胞在創(chuàng)面修復過程中發(fā)生一系列的表型變化，從而完成創(chuàng)傷修復。研究中發(fā)現表皮干細胞在維持表皮的自我更新，保持皮膚正常的表皮結構與功能方面起著重要作用。如何調動機體內的表皮干細胞來促進創(chuàng)面的愈合以及皮膚的功能性修復是人們普遍關注的研究熱點。研究發(fā)現激活組織干細胞或通過誘導損傷附近細胞去分化，再次獲得干

2、細胞特性以誘導內源性再生能力是生物界普遍存在的現象。去分化的細胞重新獲得干細胞形態(tài)和細胞分裂潛能，形成新的單元來修復損傷。近年來，在創(chuàng)傷修復領域里的去分化研究成為研究熱點。已有研究發(fā)現在特殊條件下皮膚創(chuàng)面修復過程中表皮細胞可以發(fā)生去分化，從而促進創(chuàng)面的修復。 目前，研究表皮細胞的方法主要有：(1)人體的皮膚組織活體取材；(2)對培養(yǎng)的表皮細胞進行科學研究；(3)對動物皮膚及表皮細胞進行研究，從而推測人表皮細胞在各種干預因素作用下

3、發(fā)生的變化及其機制。 本研究首先篩選一種合適的人表皮在體研究的動物模型，然后利用此動物模型對移植后的人表皮進行形態(tài)學研究。在此基礎上，進一步設計去表皮基底層細胞的表皮移植的動物模型，從而對移植的表皮細胞去分化現象進行研究，為皮膚創(chuàng)傷修復研究提供理論基礎。 實驗方法: 1、動物模型的建立應用中性蛋白酶消化后機械分離獲得包皮表皮皮片，再把表皮皮片移植到裸鼠體內。設計兩種動物實驗模型：(1)在裸鼠背部創(chuàng)面游離移植表皮皮

4、片；(2)在裸鼠背部皮下移植表皮皮片。分別于移植后3d、5d、7d取材。對標本進 HE 染色和 CK10、CK14、p63的免疫組織化學染色進行形態(tài)學研究。 2、研究表皮皮片移植到裸鼠皮下后表皮細胞的表型改變把表皮皮片移植到裸鼠皮下后于移植后3d、5d、7d取材，對標本進行HE染色和 CK10、CK14、CK19、β1整合素、PCNA、p63、c-Myc 的免疫組織化學染色進行形態(tài)學研究。 3、設計去基底層表皮皮片移植的

5、動物模型，對移植的去基底層表皮進行去分化的研究用Ⅳ型膠原反復粘貼并沖洗表皮皮片，以去除包括表皮干細胞在內的表皮基底層細胞。用免疫組織化學方法從形態(tài)學角度來驗證此方法去除基底層細胞的可行性。 把去基底層細胞的表皮皮片用 DAPI 標記后移植到裸鼠皮下，術后7d取材，對標本進行 HE 染色和 CK10、CK14、CK19、β1整合素、PCNA、p63、的免疫組織化學染色進行移植后表皮細胞表型改變的形態(tài)學研究。以α6整合素和CD71分

6、子為表皮干細胞標志物應用流式細胞儀法檢測移植后存活表皮細胞的表型改變。 實驗結果： 1、表皮皮片移植到裸鼠皮下后皮片成活，成活率較高，達60％。移植后表皮細胞增殖、生長、分化，與在體皮膚創(chuàng)傷后的表皮細胞的變化一致。CK14、p63在基底層及附基底層陽性表達。而移植表皮皮片到裸鼠背部創(chuàng)面的方法表皮成活不理想，裸鼠自身表皮逐漸生長至移植表皮下方，并最終達到創(chuàng)面愈合，移植表皮皮片脫落。 2、表皮皮片移植到裸鼠皮下后基底

7、層細胞增殖，p63、PCNA 和 CK14 在基底層和副基底層陽性表達。CK10 陽性表達于棘層和顆粒層，表達強度弱于移植前。表皮干細胞的標志物 CK19 和β1整合素陽性細胞數量明顯多于移植前表皮。c-Myc在成活的表皮基底層和副基底層細胞中陽性表達。實驗中發(fā)現，在成活的表皮皮片的棘層出現與基底層和副基底層細胞表型一致的散在分布的細胞或細胞島。 3、Ⅳ型膠原處理前后的表皮片行HE和免疫組織化學檢測顯示：處理前的表皮片可見明顯的

8、表皮角，而處理后的皮片表皮角消失，皮片的最下層無排列緊密的細胞存在。處理前的表皮片基底層的細胞CK14陽性，基底層以上CK10染色陽性，處理后CK14陰性而皮片全層CK10染色陽性。移植的去基底層表皮細胞的皮片呈間斷成活，以移植皮片有成活表皮細胞為成活標準，皮片存活率為33.3％。去基底層移植后7d的表皮皮片細胞排列分層不明顯，無整齊排列的基底層細胞，與未去基底層的表皮皮片移植7d的HE結果有明顯差別。去基底層表皮移植7d取材標本CK1

9、9和β1整合素染色陽性細胞呈多層散在分布，表皮中PCNA陽性細胞大量出現，細胞排列散在，分層不明顯，p63陽性細胞也大量出現在成活的表皮片各個層次中，有的成團樣聚集，分布不均。流式細胞儀檢測結果：去基底層表皮皮片α6<'+>CD71<'-> 細胞占0.016％，α6<'+>CD71<'+>占0.021％；移植后7d α6<'+>CD71<'-> 細胞占1.366％，α6<'+>CD71<'+>占3.528％，移植前與移植后α6<'+>C

10、D71<'->和α6<'+>CD71<'+>細胞比例有明顯差異(P<0.05)。 結論： 1、將分離的表皮皮片移植到裸鼠皮下可以成功建立人表皮在體研究實驗動物模型。這為研究人表皮細胞在皮膚創(chuàng)傷修復中的作用提供了研究平臺。 2、移植成活的表皮細胞與人體皮膚創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞發(fā)生的表型變化相似，基底層細胞增生活躍，CK14、p63、PCNA陽性細胞增多，多層分布。成活的表皮皮片中表皮干細胞標志物β1整合素和CK1

11、9陽性細胞增多，提示表皮皮片的異種移植促進了表皮干細胞的分裂、增殖。 3、移植的表皮棘層出現散在分布的島狀細胞團，免疫組化染色證實為短暫擴增細胞或表皮干細胞。在皮膚創(chuàng)傷修復過程中，一定條件下表皮細胞可能發(fā)生去分化，從而促進創(chuàng)傷修復。 4、將分離的表皮用Ⅳ型膠原反復粘連并沖洗來可以成功去除表皮基底層細胞。 5、在去表皮基底層表皮皮片移植到裸鼠的動物實驗模型研究中進一步證實了表皮細胞去分化這一生物學現象存在的可靠性。