溶葡萄球菌酶親和層析研究.pdf

1、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的出現(xiàn)并廣泛傳播，使得臨床上葡萄球菌感染治療變得十分困難。溶葡萄球菌酶（Lysostaphin）可切斷細(xì)胞壁肽聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)中g(shù)ly五肽橋聯(lián)，專一殺滅葡萄球菌屬細(xì)菌，能特異高效地殺滅MRSA，并且不產(chǎn)生耐藥性。有望成為治療MRSA感染的特效藥物。 為獲得高純度的重組溶葡萄球菌酶并達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)，本文對(duì)抗體親和層

2、析法獲取高純度的溶葡萄球菌酶進(jìn)行了系統(tǒng)研究。首先在獲得了高效表達(dá)溶葡萄球菌酶的基礎(chǔ)上，通過(guò)單克隆抗體技術(shù)，成功制備了三株可高效穩(wěn)定表達(dá)抗溶葡萄球菌酶單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（A1G5A1、A2C1D10和L1F3）,然后依據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果選擇其中效價(jià)較高的兩種抗體（A1G5A1、A2C1D10）為配基，與CNBr活化的Sepharose4B偶聯(lián)制成親和層析柱用以純化溶葡萄球菌酶，并對(duì)純化過(guò)程中吸附和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示用單克隆

3、抗體(A1G5A1)作為配基的親和層析柱在以含 0.15M NaCl的0.05M Tris-HCl(pH 8.0)為結(jié)合條件，0.1M NaAC（pH4.0)為洗脫條件對(duì)溶葡萄球菌酶樣品進(jìn)行純化時(shí)，可獲得純度大于95％的溶葡萄球菌酶，回收率可達(dá)到90％。但是純化后的溶葡萄球菌酶SDS-PAGE分析顯示在分子量17K Da處還是有雜條帶存在，經(jīng)Western blotting檢驗(yàn)，純化后的電泳雜條帶同樣成陽(yáng)性。為了除去這樣的雜條帶，利用A

4、ntheprot對(duì)溶葡萄球菌進(jìn)行了抗原性表位分析并合成了溶葡萄球菌酶分子N端3-13位的表位（THEHSAQWLN），然后利用戊二醛雙功能試劑將人工合成的多肽成功地與KLH進(jìn)行偶聯(lián)，免疫新西蘭兔制備了抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽的抗體（LTN1）,用此抗體制備的免疫親和柱對(duì)單抗（A1G5A1）純化后的溶葡萄球菌酶進(jìn)行再純化，最終獲得了純度達(dá)到98％以上的溶葡萄球菌酶，而且純化后的溶葡萄球菌酶仍保持良好的酶活性。本文對(duì)溶葡萄球菌酶免疫親和層