熱休克蛋白90α對靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、目的：通過建立大鼠靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷模型，對皮瓣局部注射外源性熱休克蛋白90α的功能基因“F-5”表達蛋白，觀察皮瓣血流灌注量變化、微血管新生情況及對皮瓣成活率的影響，進而探討熱休克蛋白90α對皮瓣缺血再灌注損傷的作用機制，并為后續(xù)研究提供理論基礎，也為該方面的臨床治療技術的轉化提供實驗依據。
　　方法：在這項研究中，首先獲取外源性熱休克蛋白90α的功能基因“F-5”表達蛋白。通過基因工程技術構建 pET15b-F-5重

2、組質粒，轉化大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL菌株；在細菌培養(yǎng)擴增后，挑選抗氨芐青霉素克隆進行快速提取，用EcoR I、BamH1雙酶切鑒定；將大腸桿菌菌種通過堿裂解法大量提取目標質粒；以氮川三乙酸鎳(Ni-NTA)金屬親和層析純化；通過Centricon YM-50裝置濃縮，然后用快速蛋白液相色譜法（FPLC）再次純化；用考馬斯亮藍法（Bradford法）對純化蛋白進行定量，獲得最終濃度為1mg/ml的外源性熱休

3、克蛋白90α“F-5”表達蛋白。
　　其次建立軸型皮瓣的靜脈淤血型缺血再灌注損傷模型。設計以大鼠腹壁淺動靜脈為蒂的軸型皮瓣，成功切取皮瓣后，除軸型供血血管——腹壁淺動靜脈與供區(qū)連接外，其余組織均游離；用微型止血夾夾住腹壁淺靜脈6小時或8小時造成靜脈回流障礙，之后再通血管，出現再灌注損傷。將60只大鼠隨機分為三個組：A組為空白對照組，在靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷模型建立后，在血管再通即刻皮下組織層注射1ml生理鹽水；B組為熱休克蛋

4、白90α預處理組，在靜脈阻斷前于皮瓣局部注射熱休克蛋白90α1ml（總量1mg）；C組為熱休克蛋白90α治療組，在靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷模型建立后，血管再通即刻皮下組織層注射相同數量熱休克蛋白90α“F-5”基因表達蛋白。每組又分為兩個再灌注時間點，即缺血6小時或8小時。
　　然后在模型建立過程中采取多種方式對各組皮瓣進行觀察，量化對比數據。用激光多普勒血流儀檢測各組皮瓣阻斷后1小時、3小時、6小時、8小時及再灌注后5分鐘、

5、30分鐘、2小時血流灌注量，以便輔助判斷大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的模型是否成功以及再灌注后各組皮瓣血流灌注量的恢復情況。術后每天觀察皮瓣的顏色、質地、厚度、毛發(fā)生長、毛細血管充盈試驗，針刺出血情況等；在術后第7日通過坐標貼紙法測定三組皮瓣的成活率；在術后第1、3、7、10、14日取樣進行蘇木素—伊紅染色及免疫組化染色，觀察皮瓣組織的病理性改變以及微血管密度計數。
　　結果：通過Western blotting檢測，SDS-聚丙烯酰胺

6、凝膠電泳中出現87KD條帶，說明提純物為目的蛋白即熱休克蛋白90α“F-5”基因表達蛋白；通過 RT-PCR及Southern blotting檢測，瓊脂糖凝膠電泳中在550bp和332bp處出現條帶，與質粒載體及熱休克蛋白90α“F-5”基因的mRNA分子量吻合，證明提純物為目的蛋白即“F-5”基因蛋白。
　　血流灌注量改變：正常情況下大鼠下腹部皮瓣的血流灌注量為（397.4±26.7），在阻斷靜脈1小時后各組皮瓣的血流灌注量均

7、明顯降低，其中空白對照組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣血流灌注量降為正常的40%左右，阻斷6小時血流灌注量降為21%，阻斷8小時血流灌注量降為15%以下；而血流恢復后再灌注5分鐘到半小時，皮瓣血流灌注量逐漸有所恢復，空白對照組、熱休克蛋白90α治療組、熱休克蛋白90α預處理組恢復幅度依次增加，但同一組內對比6小時亞組及8小時亞組，后者皮瓣的血流灌注量恢復幅度對應有明顯下降；熱休克蛋白90α預處理組在靜脈阻斷過程中及再灌注后皮瓣的血流灌注量

8、較空白對照組及熱休克蛋白90α治療組為高。激光多普勒血流儀測量影像也可見到不同組別血流灌注量的色差變化，上述變化說明軸型皮瓣的缺血再灌注損傷模型的構建是成功的。熱休克蛋白90α預處理組在缺血和再灌注各時間節(jié)點的皮瓣血流灌注量顯著高于空白對照組，也優(yōu)于熱休克蛋白90α治療組，組間對比有顯著性差異(P＜0.05)。
　　大體觀察：術后第1日空白對照組皮瓣腫脹明顯，皮瓣的中遠端不同程度出現紫紅或紫黑色，毛細血管充盈時間延長或消失，伴皮紋

9、消失，有的出現水泡；熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組水腫較空白對照組輕，有毛細血管充盈現象，時間基本正常。術后3日空白對照組皮瓣仍有腫脹，遠端壞死區(qū)域發(fā)黑，周圍伴炎性反應；熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣腫脹開始消退，較空白對照組術后第4日消退為早，遠端發(fā)黑區(qū)域范圍小，炎癥反應輕。術后7日三組皮瓣壞死界限清楚，空白對照組皮瓣遠端壞死部分發(fā)硬，有融痂現象，壞死組織部分脫落形成潰瘍；熱休克蛋白90α預處理

10、組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣成活范圍及營養(yǎng)情況均較空白對照組好。術后第14日，空白對照組壞死組織黑色痂殼脫落，下面組織愈合不佳，有肉芽組織生成；熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣創(chuàng)緣愈合好，皮瓣柔軟、溫暖，皮瓣表面有新生毛發(fā)生成。同組內阻斷6小時組各項指標情況優(yōu)于阻斷8小時組，其中空白對照組阻斷8小時組有2例皮瓣出現完全壞死。
　　皮瓣成活率：術后7日測量各組皮瓣成活率，空白對照組的平均值為（19.3±3.8）

11、%，熱休克蛋白90α預處理組為（85.6±17.6）%，熱休克蛋白90α治療組為（78.9±20.5）%，熱休克蛋白90α預處理組皮瓣成活率最高，結果有顯著性差異（P＜0.05）；同組內缺血6小時亞組皮瓣成活率均高于缺血8小時亞組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　病理組織學改變：術后1、3、7、10、14日對各組皮瓣組織行HE染色進行觀察。術后第1日，各組皮瓣組織中均可見到浸潤的炎癥細胞，毛細血管擴張明顯，血小板黏附于血

12、管壁，伴細胞腫脹，尤其以空白對照組為著，還可觀察到微血管結構模糊。術后3日，各組皮瓣細胞腫脹未消退，血管壁仍有大量炎性細胞浸潤；空白對照組可見血管內血栓形成，細胞腫脹程度較熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組明顯。術后7日，熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組顯示皮瓣的組織結構基本正常，皮膚的角質層較完整，組織結構基本正常，皮膚的角質層較完整，血管基本保持通暢，纖維組織排布整齊，炎性細胞的浸潤減少，成纖維細胞的數

13、量增加，毛細血管密度增加，有新的上皮組織生成；空白對照組皮瓣的組織結構不完整，部分區(qū)域出現角質層脫落，血管內有血栓形成，血管壁附近仍有較多浸潤的炎性細胞，血管內皮細胞和成纖維細胞增殖較少，鮮見新生毛細血管生成。術后10日，熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣組織結構恢復正常，在邊緣壞死區(qū)域下炎性細胞浸潤減少，新生毛細血管增多并伴新生組織生成；空白對照組血管壁炎性細胞數量有所減少，新生血管及新生組織不顯著。術后14日，熱休

14、克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組顯示炎性細胞數量進一步減少，新的毛細血管和成熟的成纖維細胞增加，細胞排列整齊，新的上皮組織增加，同時可見基底細胞增生；空白對照組炎性細胞數量較前進一步減少，但局部組織新生血管少，上皮細胞增生不活躍。
　　微血管密度計數情況：術后1、3、7、10、14日對各組皮瓣組織行免疫組化染色并對微血管密度進行計數。發(fā)現術后7日各組皮瓣組織中棕色的血管內皮細胞較前增多，其中熱休克蛋白90α預處理組和熱

15、休克蛋白90α治療組較空白對照組增多明顯。通過微血管密度計數對比，各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。另外，缺血6小時亞組的參數均優(yōu)于缺血8小時亞組，差異顯著(P＜0.05)。術后10日，熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組傷口附近可見新生上皮組織，甚至可見清晰的新生血管。術后14日，熱休克蛋白90α預處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣遠端皮緣愈合良好，局部黑痂脫落，可以看到較完整的表皮和真皮結構，伴新生血管的增加。<