不同施肥條件下黃瓜連作土壤微生物多樣性分析.pdf

1、隨著我國設施農業(yè)的不斷發(fā)展，連作障礙越來越突出。黃瓜作為設施蔬菜主要品種之一，近年來其連作障礙的發(fā)生機制及其防治措施受到學者們較廣泛的關注，已有的研究表明，土壤微生物區(qū)系失衡是黃瓜連作障礙發(fā)生的主要原因之一，并且認為施用有機肥及微生物肥料可以改善土壤理化性質、調節(jié)土壤微生物生態(tài)，能有效解除作物連作障礙?；实倪^量及不適當使用，也是導致土壤理化性質劣化，土壤微生物區(qū)系失衡的主要原因之一。因此通過有機肥、微生物肥以及化肥的合理施用，建立合理

2、的施肥策略，對于黃瓜種植產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。本文通過設置化肥(FT)、普通有機肥+化肥(FC)、生物有機肥+化肥(FB)以及不施肥(CK)等不同施肥處理，研究不同施肥條件下黃瓜連作過程中土壤微生物多樣性的動態(tài)變化，分析連作土壤中假單胞菌、hcnAB、phzF、黃瓜枯萎病原菌豐度的變化，并借助Illumina MiSeq測序技術，了解不同施肥措施對連作黃瓜土壤真菌群落結構的影響，以期為黃瓜連作生產中健康土壤微生物區(qū)系的維持以及連作障

3、礙的預防及緩解提供理論基礎。主要研究結果如下:
　　(1)利用稀釋平板計數(shù)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)等方法，分析了不同施肥處理條件下連作7茬黃瓜土壤細菌、放線菌和真菌數(shù)量及多樣性的動態(tài)變化，結果表明:隨著連作茬數(shù)的增加，根際土壤微生物數(shù)量呈逐漸增加趨勢;與對照相比，F(xiàn)T處理總體上明顯促進了連作土壤中放線菌、真菌數(shù)量的增加，而對細菌數(shù)量的增加有明顯抑制作用;有機肥施用對細菌、放線菌數(shù)量的增加均有不同程度的促進作用，除生物

4、肥連作后期（5茬后）對真菌數(shù)量的增加有促進作用外，有機肥施用總體上抑制了土壤真菌數(shù)量增加。連作及不同施肥方式對土壤細菌群落結構均產生不同程度影響，除對照外，各施肥處理土壤細菌多樣性以及豐富度隨著連作茬數(shù)的增加均呈現(xiàn)下降趨勢，相對于FT及FC處理，F(xiàn)B處理對于維持連作過程細菌多樣性及豐度具有明顯的積極意義;各施肥處理土壤真菌多樣性以及豐富度隨著連作茬數(shù)的增加均呈現(xiàn)上升趨勢，但與不施肥處理相比上升幅度較小，且連作7茬后土壤真菌多樣性及豐富度

5、表現(xiàn)為FB＞FC＞FT。
　　(2)采用RT-PCR和PCR-DGGE方法，對第1茬及第8茬黃瓜連作土壤假單胞菌豐度及多樣性進行了分析，結果表明:與CK相比，各種肥料施用對第1茬黃瓜根際土壤假單胞菌豐度的增加均有明顯促進作用，連作8茬后FT處理明顯降低了假單胞菌豐度，而有機肥處理對豐度的影響不明顯;與第1茬相比，各施肥處理連作8茬后土壤假單胞菌豐度及相對豐度均明顯下降。連作使土壤假單胞菌群落結構的多樣性及豐富度有一定程度的增加，并

6、且第1茬不同施肥處理間差異較大，而連作8茬后差異度明顯下降，在維持黃瓜連作過程土壤假單胞菌多樣性及豐富度的能力上FB＞FT＞FC;對假單胞菌DGGE條帶測序比對可知，連作使各施肥處理Pseudomonas fluorescens、Pseudomonasputida、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas sp.等有益菌豐度均有增加;FB處理對Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas

7、 putida、Pseudomonas stutzer、Pseudomonasalcaligenes、Pseudomonas sp.等有益菌豐度增加均有促進作用，而FC處理Pseudomonasalcaligenes豐度有所下降。連作增加了對黃瓜土傳病害具有拮抗作用假單胞菌有益菌群的豐度，生物有機肥的施用能夠促進有益菌群豐度的增加。
　　(3)利用RT-PCR方法，分析不同施肥條件下黃瓜連作土壤與土傳病發(fā)生相關的尖孢鐮刀菌(MAT

8、)、黃瓜枯萎病原菌(OPZ)的豐度以及與土傳病原真菌控制相關的hcnAB、phzF等功能基因豐度的變化。結果表明:連作導致土傳病發(fā)生相關基因相對豐度呈下降趨勢，這種趨勢在普通有機肥處理中更為明顯，而化肥、生物有機肥處理對這種趨勢具有抑制或緩解作用;連作導致可能對土傳病菌具有抑制作用的假單胞菌的相對豐度呈現(xiàn)下降趨勢，這種趨勢在化肥、生物有機肥處理中更為明顯，而普通有機肥處理對這種趨勢具有抑制或緩解作用;此外，土傳病發(fā)生相關基因相對豐度與可

9、能對土傳病菌具有抑制作用的假單胞菌的相對豐度呈現(xiàn)負相關。
　　(4)應用Illumina Miseq平臺，對CK、FT、FC、FB以及FCB(化肥+普通有機肥+微生物有機肥)等施肥處理連作8茬土壤真菌IST1區(qū)進行了高通量測序，共計獲得了2，696，679條有效序列及2，036，675條優(yōu)質序列。
　　Alpha多樣性分析結果表明:與CK相比，F(xiàn)C、FT處理對非根土壤真菌豐富度提高有促進作用;FT、FB、FC及FCB處理均不

10、同程度地降低了根際土壤真菌多樣性及豐富度，該結果與前述第7茬黃瓜連作土壤真菌PCR-DGGE分析結果一致。
　　比較不同肥料處理土壤真菌主要門相對豐度可知:與CK相比，化肥、有機肥的施用總體上均降低了土壤Ascomycota、Glomeromycota、Zygomycota相對豐度，其中FC處理下降幅度最大;化肥、有機肥的施用均增加了根際土Basidiomycota相對豐度，但在非根際土中，除了FB處理，其余處理均顯著降低了Bas

11、idiomycota相對豐度;除了FCB處理，其余處理Chytridiomycota相對豐度均有不同程度的增加，其中FT處理增加幅度最大。
　　土壤中最豐富的前20種OTUs統(tǒng)計結果表明:豐度排在最前的4個種類分別為Fusarium solani、Fusarium oxysporum、Acremonium sp.、Mortierella alpina，而根際土壤中豐度排在最前的4個種類分別為Fusarium solani、Asco

12、mycota sp.、Fusarium oxysporum及Acremonium sp.。對土壤20個最豐富物種中的土傳病原真菌及作物生長有益菌相對豐度進行施肥處理間差異顯著性分析，結果表明:相對于CK及FT處理，不同有機肥處理對根際、非根際土壤不同土傳病原真菌豐度具有不同程度的控制作用，同時，不同施肥處理土壤有益真菌豐度也有不同程度的下降。
　　Beta多樣性分析結果表明，無論根際土還是非根際土，化肥處理與不施肥處理群落結構差異

13、較小，F(xiàn)B、FC及FCB等3種有機肥處理群落結構與CK差異均較大，并且生物有機肥與普通有機肥處理間群落結構均有較大的分異度。通過主成分分析(PCA)以及屬分類水平上的聚類分析均獲得相似結果。
　　RDA分析結果表明:不同施肥處理導致土壤真菌群落結構的明顯分化，與多種土壤理化因子密切相關，其中，pH以及氨態(tài)氮含量與CK及FT處理土壤真菌群落結構的形成關系密切，而全氮、速效磷、速效鉀、有機碳、全磷、硝態(tài)氮等理化因子共同影響FC、FB及