Fgfr2S252W-+小鼠骨量、骨結構特性及BMSCs成骨分化調控機制的研究.pdf

1、目的:
　　Apert綜合征(Apert syndrome，AS)是臨床最嚴重的人類顱縫早閉。本研究將以Fgfr2S252W/+小鼠和BMSCs作為研究平臺和實驗切入點，通過比較野生型小鼠和Fgfr2S252W/+小鼠的長骨骨量、BMSCs的生物學特性、BMSCs成骨分化能力、BMSCs的基因差異表達，從整體動物水平、細胞及分子水平研究FGFR2S252W突變中BMSCs的生物學變化、FGFR2 S252W突變對BMSCs成骨分化

2、的調控作用及其分子機制、FGFR2調控BMSCs成骨分化中與其它信號通路的協(xié)同作用。本研究不僅對于深入認識Apert綜合征病理生理機制意義重大，而且能夠揭示FGFR2參與調控BMSCs成骨分化的作用及機制，為骨再生和骨骼相關疾病治療的新策略提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　為了獲取Fgfr2S252W/+小鼠進行實驗，我們首先對Fgfr2S252W/+小鼠進行保種、繁殖、基因型鑒定。Micro-CT掃描并分析來自2月齡和

3、5月齡小鼠的股骨骨量。骨量的分析數(shù)據(jù)包括:骨小梁和骨皮質體積分數(shù)(Tb.BV/TV，Ct.BV/TV，％)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)，骨小梁和骨皮質的厚度(Tb.Th，Ct.Th)，骨小梁分離(Tb.Sp)，骨小梁結構模型指數(shù)(Tb.SMI)，骨小梁和皮質骨礦物質密度(Tb.BMD，CT.BMD)。利用H&E染色和Von Kossa染色對脫鈣骨和未脫鈣骨進行組織學分析，以確定Fgfr2S252W/+小鼠中骨量的改變是否是由于骨骼的形成改變

4、導致。OsteoMeasure系統(tǒng)分析脛骨的Tb.BV/TV和Tb.Sp。測定小鼠血清中總鈣和磷酸鹽水平，以確定在Fgfr2S252W/+小鼠中觀察到的骨骼異常是否與系統(tǒng)性的礦物質平衡改變有關。PINP是一種敏感和特異性的成骨細胞活性標志物，所以我們用ELISA法檢測血清中PINP的水平。
　　從6至8周齡同窩野生型和Fgfr2S252W/+小鼠股骨和脛骨獲得BMSCs。利用流式細胞儀技術對野生型和Fgfr2S252W/+小鼠來源

5、的BMSCs進行干細胞表面分子標志物的檢測。為了比較野生型和Fgfr2S252W/+小鼠來源的BMSCs的功能，我們采用CCK-8法以及流式細胞儀檢測BMSCs增殖、生長周期以及凋亡。為了進一步比較兩種小鼠來源的BMSCs多向分化能力差異，對兩種BMSCs進行了成骨和成脂的定向誘導分化實驗，同時采用油紅O染色和茜素紅染色對脂滴和礦化結節(jié)進行檢測，采用RT-PCR對成骨以及成脂的關鍵基因Oc、Runx2與PPARγ、LPL進行檢測。

6、>　　為了解FGFR2功能獲得性突變對小鼠BMSCs成骨分化能力的影響，我們對W-BMSCs和M-BMSCs兩組細胞進行成骨能力檢測。首先將BMSCs成骨誘導4d、7d、14d后，檢測成骨早期標志基因ALP的活性和染色。然后將BMSCs成骨誘導7d、14d和21 d后采用免疫熒光方法檢測成骨的關鍵蛋白Op，Oc的表達情況，同時采用RT-PCR進一步確定細胞成骨基因Col-Ⅰ，Op，Oc，Runx2和OSX的表達水平。最后將細胞成骨誘導2

7、1d后，采用茜素紅染色檢測其礦化能力。
　　為研究FGFR2 S252W功能獲得性突變影響下BMSCs成骨分化中與其它信號通路的協(xié)同作用，我們利用基因芯片技術比較分析W-BMSCs和M-BMSCs兩組細胞基因差異表達，找到有意義的基因。利用基因芯片技術中聚類分析芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，M-BMSCs中Wnt信號通路的抑制基因SFRP1、SFRP2和SFRP4表達上調。這種上調采用RT-PCR和Western Blot進行驗證。SFRP1

8、、SFRP2和SFRP4是Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，我們猜測Wnt/β-catenin信號通路在FGFR2 S252W功能獲得性突變下受到了抑制。為驗證這一猜想，我們將W-BMSCs和M-BMSCs成骨誘導7d和21 d，分離提取胞漿、胞核蛋白，利用Western Blot檢測Wnt/β-catenin信號通路的樞紐分子β-catenin的表達情況，RT-PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路關鍵靶向基因cycl

9、inD1，lef1，and fzd4的表達水平。
　　如果Fgfr2S252W/+小鼠中BMSCs的生物學特性及成骨分化異常是由于Wnt/β-catenin信號通路被抑制造成，那么Wnt/β-catenin信號通路被激活可以減輕BMSCs的異常。Wnt3a可以上調Wnt/β-catenin信號通路，此部分實驗我們將應用Wnt3a外源性重組蛋白調控Wnt信號通路。采用CCK-8分析加入Wnt3a后M-BMSCs細胞增殖能力，RT-P

10、CR檢測成骨基因Op，Oc，Runx2，OSX，Col-Ⅰ以及成脂基因PPARγ、LPL的變化趨勢，ALP和茜素紅染色觀察改變Wnt信號通路活性后M-BMSCs成骨能力和礦化能力的變化。
　　結果:
　　1.小鼠股骨結構參數(shù)數(shù)據(jù)顯示，2月齡Fgfr2S252W/+小鼠中Tb.N，Tb.Th，Ct.Th，Tb.BV/TV，Ct.BV/TV，Tb.BMD和Ct.BMD均低于野生型小鼠。
　　2.與W-BMSCs細胞相比，M

11、-BMSCs的細胞形態(tài)無顯著性差異，但細胞數(shù)量較少。
　　3.ALP染色和活性檢測結果顯示，成骨誘導4d、7d和14d時，M-BMSCs的ALP活性低于W-BMSCs，除14d外，其差異有顯著性。免疫熒光結果顯示在成骨誘導7d、14d和21 d后W-BMSCs、M-BMSCs兩組細胞均表達成骨早期和晚期標志性蛋白Oc、Op。RT-PCR結果顯示，F(xiàn)GFR2 S252W功能獲得性突變作用下，BMSCs成骨誘導4d時Col-I、Op、

12、Oc、Runx2、OSX的表達水平顯著低于W-BMSCs。
　　4.利用基因芯片技術中聚類分析芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，M-BMSCs中Wnt/β-catenin信號通路的抑制基因SFRP1、SFRP2和SFRP4表達上調。RT-PCR和Western Blot結果進一步證實了SFRP1、SFRP2和SFRP4的表達上調。
　　5.加入Wnt3a，上調Wnt/β-catenin信號通路后，M-BMSCs增殖能力增強。成脂誘導之后觀察

13、到M-BMSCs的成脂分化能力顯著增強。
　　結論:
　　1、對2月齡和5月齡Fgfr2S252W/+小鼠長骨的骨量、骨結構特性及成骨細胞活性進行研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，F(xiàn)gfr2S252W/+小鼠的骨量沒有喪失，反而增加，與野生型相比，2月齡Fgfr2S252W/+小鼠骨發(fā)育受到抑制而5月齡Fgfr2S252W/+小鼠骨發(fā)育反而高于野生型。其原因與全身機體的系統(tǒng)性礦物質平衡無關，可能是由成骨細胞的活性改變。
　　2

14、、FGFR2 S252W功能獲得性突變未改變小鼠BMSCs干細胞標記物特點，但影響了干細胞的數(shù)量、增殖能力、多向分化能力及凋亡。這為進一步探討Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs的功能提供了基礎。
　　3、FGFR2 S252W功能獲得性突變在成骨分化早期BMSCs的骨向分化潛能受到抑制，但在晚期卻促進BMSCs的成骨礦化。這與小鼠體內(nèi)觀察到的與年齡相關的骨發(fā)育狀況的改變情況一致。
　　4、FGFR2 S252W功能獲得性

15、突變抑制了BMSCs的Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路。并且通過上調Wnt/β-catenin信號通路能夠恢復或部分逆轉BMSCs增殖、成脂分化及骨向分化功能的異常。提示:Wnt/β-catenin信號通路的抑制可能是FGFR2 S252W功能獲得性突變的BMSCs成脂、成骨分化能力改變的主要原因之一。
　　總之，本研究確證了與年齡相關的Fgfr2S252W/+骨量和骨結構特性表型的改變，同時證實Wnt/β-catenin經(jīng)