抗RON受體酪氨酸激酶單克隆抗體的制備和生物學特性研究.pdf

1、酪氨酸激酶受體(RTK)是一類具有特殊結構的穿膜蛋白.目前,己經有20種RTK家族被發(fā)現(xiàn).RTK的異常激活能在很多病理情況下被檢測到,比如EGFR家族的高表達和異常激活是乳腺癌和肺癌病程進展的重要標志.因此,RTK可被作為一個腫瘤治療干預的靶向位點.像目前應用于臨床的赫賽汀就是一種EGFR2(Her2)的單克隆抗體,它已經在乳腺癌和肺癌的治療中體現(xiàn)出了非常顯著的效果. RON受體酪氨酸激酶(recepteur d'origine nan

2、tais,RON)屬于MET原癌基因家族.自從于1993年被發(fā)現(xiàn)后,對其生物化學以及生物學特性的研究已經耳義得了重要的進展.研究發(fā)現(xiàn)RON在胚胎發(fā)育、腫瘤惡性表型形成以及炎癥機制中起著重要的作用. 本實驗通過以轉染RON的NIH 3T3細胞為抗原制備抗RON的單克隆抗體,鑒定該抗體的特性,研究它對結腸癌RKO細胞系在5-氟尿嘧啶(5-Fu)化療耐藥方面的影響,并試圖探討其中的相關機制. [實驗方法]: 1.用重組

3、質粒pDR2-wt-RON、pcDNA3.1-RON△160分別轉染小鼠胚成纖維細胞NIH 3T3和結腸癌細胞RKO,克隆化培養(yǎng)出wt-RON NIH 3T3、wt-RONRKO、RON△160 RKO細胞株. 2.以wt-RON NIH 3T3為細胞抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合,然后用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞. 3.用改良的間接免疫法篩選出具有能分泌抗、wt-RON NIH 3T3

4、而小抗NIH 3T3的雜交瘤細胞株. 4.有限稀釋法單克隆化培養(yǎng)雜交瘤細胞株,并再次用改良間接免疫熒光法篩選細胞株. 5.用篩選出的產單克隆抗體雜交瘤細胞株注射到小鼠腹腔以制備腹水瘤,通過收集腹水取得單克隆抗體粗品,并以正辛酸-硫酸氨法提純. 6.用制備的5種抗體以改良的間接免疫熒光法分別檢測NIH 3T3、wt-RON NIH3T3、RKO、wt-RON RKO、RON△160 RKO、293、HT-29、DL

5、D1、Lovo、MCF7等10個細胞株RON的表達. 7.用MTT比色法檢測wt-RON RKO、RON△160 RKO細胞株對化療藥物5-Fu的耐藥性影響. 8.用MTT比色法檢測單抗對wt-RON、RON△160 RKO細胞株的生長以及5-Fu耐藥方面的作用. [結果]: 1.制備出18株產抗體雜交瘤細胞株,其中15株能夠穩(wěn)定分泌抗體.2.5株抗體對10個細胞系的特異性結合情況各有不同,但基本能夠反應

6、其對表達RON、和RON變異體細胞的特異性結合能力.3.相比RKO、wt-RON RKO細胞,RON△160 RKO細胞對5-Fu具有更強的化療耐藥性.MSP在對5-Fu的耐藥性形成方面未表現(xiàn)出明顯作用.4.5株抗體對wt-RON RKO、RON△160 RKO細胞株無明顯的中和活性,其中4株反而可增加細胞對5-Fu的耐藥性.[結論]1.制備出具能分泌RON特異性單克隆抗體的1 5個細胞株. 2.RON變異體的表達可產生抗凋亡作