狂犬病病毒中和抗體ELISA檢測方法的優(yōu)化.pdf

1、在中國，由狂犬病病毒引起人間狂犬病的死亡人數一直位居37種法定公開傳染病前列。其中，大多數案例與犬只咬傷相關。因此，確保犬只對狂犬病病毒的防御能力是切斷其向人間傳播的重要手段。目前，公認的量化犬只狂犬病病毒抵抗能力的方法是測定犬血液中中和抗體的水平。但中和試驗對實驗條件要求高且需要使用狂犬病病毒強毒株，而目前市面上的商品化試劑盒檢出的為狂犬病全病毒抗體。因而檢測狂犬病病毒的中和抗體難以普及。
　　本研究的目的是完善一套準確而又便捷

2、的狂犬病病毒中和抗體ELISA試劑盒。首先，確定表達狂犬病病毒糖蛋白優(yōu)勢抗原RV G3的工程菌能高效表達。用IPTG誘導4h后，收集菌體。重懸并在低溫環(huán)境下超聲破碎菌體，收集包涵體沉淀。然后，通過8 mol/L尿素的溶解液溶解包涵體。過純化柱獲得高度純化的RV G3蛋白，以該蛋白為抗原包被反應板，建立狂犬病病毒中和抗體間接ELISA方法。
　　經反復試驗，確定RV G3蛋白的最佳包被濃度是163μg/mL；最佳包被條件為37℃1.

3、5 h；最適的封閉劑是無蛋白封閉液；最佳封閉時間為1 h；血清最佳稀釋度是1:10；最佳血清孵育時間是1.5 h；最佳血清稀釋液為0.5％的脫脂乳；酶標二抗最適濃度為1:1000；最佳酶標二抗孵育時間為1 h；底物液反應時間為15 min；讀數波長為450 nm。
　　此外，重復性實驗表明批內和批間重復性的變異系數均小于10%。敏感性實驗表明敏感度為1:160。利用此方法檢測22份犬血清樣品，計算的中和抗體滴度結果分別與商品化EL