吉西他濱對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡及Bcr-Ab1 mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　慢性粒細(xì)胞白血病是一種發(fā)生于多能造血干細(xì)胞的惡性骨髓增生性疾病,占成人白血病的15％。在受累的細(xì)胞系中,可找到Ph染色體和(或)Bcr-Abl融和基因,其蛋白產(chǎn)物在慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展過程中起著主要作用。慢粒中位生存期為3—5年,而急性變期為慢粒的終末期,臨床表現(xiàn)與急性白血病類似,預(yù)后極差,目前治療效果不滿意,往往在數(shù)月內(nèi)死亡。K-562是一種從一個(gè)慢粒急變期病人體內(nèi)獲得的紅白血病細(xì)胞系,在慢粒急變期細(xì)胞的基礎(chǔ)研

2、究中發(fā)揮重要作用。鹽酸吉西他濱(2-脫氧-2’,2-鹽酸二氟脫氧胞苷(β-異構(gòu)體))是一種新型嘧啶類核苷酸抗代謝腫瘤藥物,主要作用于DNA合成期(S期)的腫瘤細(xì)胞,可以阻止G1期向S期的進(jìn)展。吉西他濱的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和代謝途徑與阿糖胞苷相似但其磷酸化效率比阿糖胞苷強(qiáng)。
　　其作用機(jī)制:
　　①吉西他濱二磷酸鹽(dFdCDP)抑制核糖核苷酸還原酶,減少DNA合成修復(fù)所需的脫氧核苷酸量。
　　②dFdCTP與dCTP競爭進(jìn)入D

3、NA鏈,一旦吉西他濱三磷酸鹽分子插入DNA鏈,就能阻止DNA鏈的合成,而且DNA聚合酶不能去除摻入的dFdCTP,修復(fù)DNA鏈,DNA合成停止,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前已被廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤的治療,因其療效肯定,副作用小被美國FDA批準(zhǔn)為非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌以及乳腺癌的一線化療藥。最近國內(nèi)外有一些關(guān)于核苷類似物作用于慢性粒細(xì)胞白血病單獨(dú)或聯(lián)合治療的研究報(bào)導(dǎo),尋求對(duì)伊馬替尼耐藥以及慢粒進(jìn)展期治療的新方法。
　　本實(shí)驗(yàn)是以K-562白血病細(xì)胞

4、系為研究對(duì)象,研究吉西他濱在一定濃度范圍內(nèi)能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且誘導(dǎo)凋亡過程中,致病基因Bcr—Abl基因mRNA表達(dá)的變化情況,從而觀察吉西他濱對(duì)K-562細(xì)胞增殖凋亡以及Bcr—Abl基因mRNA表達(dá)的影響,并探討其作用機(jī)制,為吉西他濱作用于慢粒急變期的治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用水溶性四唑鹽光吸收法(WST-1)檢測0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml的吉西他濱分別作用于K-562細(xì)胞1

5、2h、24h、48h、72h后細(xì)胞的增殖情況,計(jì)算增殖抑制率,并找出GEM作用于K-562細(xì)胞的最適時(shí)間和最適濃度。
　　2.采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL技術(shù))檢測10μg/ml吉西他濱作用于K-562細(xì)胞48h后細(xì)胞的凋亡情況。以細(xì)胞核內(nèi)著棕黃色顆粒為陽性。每張涂片隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽性率(陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/300×100％)。
　　3.應(yīng)用RT-PCR方法檢測10μg/ml吉西他濱作用

6、于K-562細(xì)胞48h后Bcr-AblmRNA表達(dá)的變化,陽性對(duì)照組為10μg/ml阿糖胞苷,空白對(duì)照組未加藥物。
　　4.所得結(jié)果應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,對(duì)計(jì)數(shù)資料采用χ~2檢驗(yàn),對(duì)計(jì)量資料,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.鹽酸吉西他濱對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響:采用WST-1比色法檢測結(jié)果顯示:0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L的吉西他

7、濱分別作用于K562細(xì)胞48h,結(jié)果顯示,吉西他濱對(duì)K562細(xì)胞增殖有一定的抑制作用,其抑制率分別為18.7％,23.9％,29.3％,明顯強(qiáng)于同濃度阿糖胞苷組;吉西他濱組間兩兩比較,抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。其抑制作用的最佳作用濃度為10mg/L;進(jìn)一步行組間兩兩比較,48h內(nèi)隨著作用時(shí)間的延長抑制率增加,但10mg/L吉西他濱48h與72h吉西他濱對(duì)K562細(xì)胞的抑制率無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其抑制作用的最適作用時(shí)間為48h。
　

8、　本實(shí)驗(yàn)表明,吉西他濱具有抑制K-562細(xì)胞增殖的作用,其作用的最適濃度為10μg/ml,最適時(shí)間為48h。
　　2.吉西他濱對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用:10mg/L吉西他濱作用于K562細(xì)胞48h后,TUNEL法檢測陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽性細(xì)胞率發(fā)現(xiàn),吉西他濱對(duì)K562細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)凋亡作用,陽性細(xì)胞數(shù)47,陽性率為15.3％,與空白對(duì)照組(陽性細(xì)胞數(shù)6,陽性率2.0％)和阿糖胞苷組(陽性細(xì)胞數(shù)11,陽性率3.7％)比較差異均具

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而阿糖胞苷組和空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.吉西他濱對(duì)K562細(xì)胞Bcr-Abl融合基因表達(dá)的影響:RT—PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,作用48h后,10mg/L吉西他濱組,10mg/L阿糖胞苷組和空白組的Bcr-Abl相比條帶灰度明顯減弱,其融合基因mRNA的灰度值分別為0.12,0.15和0.40。與空白對(duì)照組相比,吉西他濱組降低了K562細(xì)胞Bcr-Abl融合基因mRNA的表達(dá),和阿糖胞苷組相