職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎病例血清差異蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎(Occupational medicareentose-like dermatitis induced by trichloroethylene exposure，OMLDTE)，OMLDTE已經(jīng)成為了研究的熱點問題。研究內(nèi)容主要集中在病例的回顧性職業(yè)流行病學調(diào)查、病例易感基因多態(tài)性、免疫損傷機制等方面。已有的研究表明N-乙?；D(zhuǎn)移酶(NAT2)基因Kpn1位點的變異可明顯增加OMLDTE的危險性，具有NAT2

2、慢代謝基因型的個體患皮炎危險性明顯高于快代謝基因型個體；對醛脫氫酶、醇脫氫酶基因多態(tài)性的研究表明人醛脫氫酶2(AL2H2)變異型基因頻率在病人中顯著低于職業(yè)性TCE接觸工人，使OMLDTE的危險性顯著降低；HLA-B*1301等位基因的多態(tài)性與OMLDTE有很強的關(guān)系；但遺憾的是這些研究結(jié)果尚處于基礎(chǔ)研究階段，尚未在人群中驗證，因此還無法作為有效的預(yù)防手段應(yīng)用于實際工作。近年來蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展使得該技術(shù)在各個領(lǐng)域的應(yīng)用都取得豐碩的成

3、果。血清是一種復雜的體液成份，其蛋白組成除了白蛋白、免疫球蛋白(主要是IgG)等高豐度蛋白外，絕大多數(shù)是機體組織、細胞分泌和脫落到血中的低豐度蛋白質(zhì)，其中一些為信號傳導和調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。如果能在血清蛋白中尋找疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)標記物，將有利于闡明疾病的發(fā)病機理并通過血清學的檢測達到早期預(yù)防、診斷和治療疾病的目的。因此開展OMLDTE的血清差異蛋白質(zhì)組學研究，尋找并鑒定低豐度的功能性蛋白質(zhì)，將有利于闡明OMLDTE的發(fā)病機理，為預(yù)防OMLD

4、TE的發(fā)生提供科學依據(jù)。 目的： 1.了解OMLDTE病例和職業(yè)性TCE接觸工人TCE的暴露水平，闡明OMLDTE病例的發(fā)病特征以及職業(yè)性TCE接觸工人的暴露應(yīng)激情況； 2.構(gòu)建人外周血血清蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳平臺及優(yōu)化實驗條件； 3.了解OMLDTE病例發(fā)病急性期及恢復期血清蛋白質(zhì)的變化情況； 4.鑒定差異表達蛋白質(zhì)，了解蛋白的功能，以利于進一步了解OMLDTE涉及的病理過程，為進一步研究OMLD

5、TE免疫機制提供科學的線索。 方法： 1.研究對象： 8例OMLDTE病例用于血清差異蛋白質(zhì)組學研究，63例職業(yè)性TCE接觸工人用于與OMLDTE病例進行比較，闡明其發(fā)病特征。 2.職業(yè)流行病學調(diào)查對OMLDTE病例進行一般情況和職業(yè)接觸的問卷調(diào)查，病例所在的作業(yè)場所空氣中TCE濃度的測定，病例發(fā)病急性期和恢復期的生化、血液常規(guī)與尿常規(guī)等指標的檢查；對63例職業(yè)性TCE接觸工人進行一般情況和職業(yè)接觸的問卷

6、調(diào)查，工人所在作業(yè)場所空氣中TCE濃度的測定，工人班后尿中三氯乙酸(Trichloracetic acid，TCA)濃度的測定，皮膚檢查、血清AST、ALT以及T-Bil等生化指標的測定。 3.人外周血血清蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(two-dimellsional gel electrophoresis，2-DE)條件的優(yōu)化建立去除血清高豐度蛋白的方法，并對2-DE的條件，包括聚丙烯酰胺凝膠濃度、IPG膠條的pH范圍、蛋白質(zhì)上樣量、銀

7、染方法、水化上樣液體積、電泳程序參數(shù)等進行摸索，得到穩(wěn)定性高、重復性好的2-DE銀染圖譜。 4.OMLDTE病例發(fā)病急性期和恢復期血清蛋白的2-DE差異分析采用標本混合(sample pooling)策略，運用優(yōu)化后的2-DE條件對OMLDTE病例發(fā)病急性期和恢復期的血清蛋白進行分離。使用PDQuest7.4.0圖像分析軟件對分離后的2-DE蛋白銀染圖譜進行差異分析，篩選出有代表性的差異表達蛋白。在部分個體中驗證從混合標本中分析

8、得到的差異表達蛋白質(zhì)。 5.OMLDTE病例發(fā)病急性期和恢復期血清差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和功能探討運用飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對差異表達蛋白點樣品進行MALDI-TOF-TOF MS分析，獲得血清差異蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖。完成MS后，選擇強度最大的4個峰進行串級質(zhì)譜分析。最后采用聯(lián)合檢索的方式，應(yīng)用GPS-MASCOT進行NCBInr數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合檢索，鑒定該蛋白點為何種蛋白質(zhì)。查詢文獻，了解這些差異蛋白的功能，探討這些差異蛋白在O

9、MLDTE中可能發(fā)揮的作用。 6.統(tǒng)計分析方法數(shù)據(jù)一般用平均數(shù)±標準差表示((x)±s)，變異大的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)表示；多組之間比較采用方差分析及卡方檢驗進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果： 1.現(xiàn)場職業(yè)流行病學調(diào)查對比OMLDTE患病人群和職業(yè)性TCE接觸人群的情況表明：OMLDTE的發(fā)生呈現(xiàn)個體特異性，呈典型的免疫變態(tài)反應(yīng)；在相同環(huán)境的暴露濃度下只有個別人發(fā)病，其它人不發(fā)病，提示與遺傳易感因素有關(guān)；發(fā)病與接觸的TCE濃度不

10、呈劑量—反應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)為暴露在9.1mg／m3也可以發(fā)病，而暴露于1181mg／m3的工人未見發(fā)病，發(fā)病與暴露濃度不呈規(guī)律；病人發(fā)病以發(fā)熱、皮疹、肝損害以及淺表淋巴結(jié)腫大為主，部分病例合并腎、眼損害，而在職業(yè)性TCE暴露人群中未出現(xiàn)該中毒表現(xiàn)。 2. 2-DE條件的優(yōu)化人外周血血清中的蛋白質(zhì)經(jīng)Qiagen公司生產(chǎn)的Aurum／IgG Depletion Spin Column過濾去除白蛋白和IgG后，應(yīng)用100～150μg的過濾

11、蛋白質(zhì)上樣，上樣緩沖液終體積為350μL泡漲，經(jīng)pH3-10NL IPG膠條進行等電聚焦(IEF)，繼而12％濃度聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE，運用Amersham推薦方法加以改進進行銀染，配合調(diào)整優(yōu)化其他一些必要的條件，獲得比較理想的蛋白質(zhì)圖譜。 3.OMLDTE病例發(fā)病急性期和恢復期血清蛋白的2-DE差異分析 3.1 2-DE銀染凝膠圖譜的重復性分析經(jīng)過Bio-Rad公司的PDQuest7.4.0軟件分析后，獲

12、得OMLDTE病例發(fā)病急性期和恢復期血清蛋白凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為582±31和595±28。經(jīng)過背景消減后，將其中的一塊膠定為參考膠進行3塊膠間蛋白質(zhì)點的匹配，OMLDTE病例發(fā)病急性期血清的2-DE膠間平均匹配的點數(shù)為483±29，匹配率達82.9％；OMLDTE病例恢復期血清的2-DE膠間平均匹配的點數(shù)為491±27，匹配率達82.5％。說明本實驗的2-DE系統(tǒng)重復性較好。 3.2 2-DE圖譜的差異分析經(jīng)軟件分析和人工確

13、認pH3-10NL圖譜中的差異點發(fā)現(xiàn)：僅在OMLDTE病例發(fā)病急性期中出現(xiàn)的差異蛋白點共13個；僅在恢復期出現(xiàn)的差異蛋白點只有1個；表達豐度比值在3倍以上的差異蛋白質(zhì)點共有27個，其中發(fā)病急性期表達量為恢復期3倍以上的蛋白點有8個，恢復期表達量為發(fā)病急性期3倍以上的蛋白點有19個。經(jīng)3例個體驗證，40個差異表達蛋白點在部分個體均以一定比例出現(xiàn)，只有1個差異表達蛋白點在全部驗證個體中均不出現(xiàn)。 3.3標本混合策略的評價通過比較和分

14、析混合標本圖譜和個體標本圖譜，充分證明本研究采取的標本混合策略是正確的、可行的，通過這種有效的方式，我們可以準確的找出大部分個體所具有的有意義的蛋白質(zhì)點。 4.血清差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和功能探討通過MALDI-TOF-MS／MS質(zhì)譜鑒定蛋白以及肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)庫查詢分析蛋白的方法，成功鑒定了33個蛋白質(zhì)。分別為只在急性期表達的S1OOA8、血清淀粉樣蛋白A、S1OOA8／S1OOA9、鐵蛋白輕鏈、亮氨酸氨肽酶、肝組織1，6

15、-二磷酸果糖縮醛酶A鏈、著絲粒蛋白F等；發(fā)病急性期比恢復期表達增加的重組血紅蛋白A鏈、Lepore-Baltimore血紅蛋白、脂蛋白CⅢ、血漿谷胱甘肽過氧化物酶、載脂蛋白E前體；恢復期比急性期表達增加的視黃醇結(jié)合蛋白、人乙酰輔酶A羧化酶、載脂蛋白M、α結(jié)合珠蛋白2、α-微球蛋白／bikunin前體、結(jié)合珠蛋白、角蛋白1、血紅素蛋白前體、羧肽酶N，多肽1前體、人補體C3 B鏈、人伴肌動蛋白相關(guān)錨定蛋白、醛縮酶B等。 本研究分離并

16、鑒定的差異表達蛋白大多數(shù)與OMLDTE的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可能為OMLDTE潛在的效應(yīng)標志物。 結(jié)論： 1.OMLDTE的發(fā)生呈現(xiàn)個體特異性，呈典型的免疫變態(tài)反應(yīng)，與遺傳易感因素有關(guān)；病人發(fā)病以發(fā)熱、皮疹、肝損害以及淺表淋巴結(jié)腫大為主，部分病例合并腎、眼損害；TCE職業(yè)暴露人群未見該類表現(xiàn)。 2.構(gòu)建了重復性、穩(wěn)定性良好的血清蛋白質(zhì)2-DE平臺，優(yōu)化了血清蛋白質(zhì)分離的試驗條件，為進一步分離、鑒定和分析OMLDTE相

17、關(guān)的血清蛋白質(zhì)研究打下良好基礎(chǔ)。 3.采用標本混合策略分離OMLDTE病例血清蛋白質(zhì)，有效的消除個體差異，降低了分析的復雜性。通過運用部分個體標本驗證混合標本結(jié)果，確定了混合標本中的差異表達蛋白質(zhì)大部分均在個體標本中出現(xiàn)，證明了標本處理策略的科學性，為進一步開展OMLDTE病例血清差異蛋白質(zhì)組學的研究提供了可靠的基礎(chǔ)。 4.對OMLDTE病例發(fā)病急性期和恢復期混合血清進行2-DE分離和PDQuest軟件分析得到了41個差