絲裂霉素C對瘢痕疙瘩成纖維細胞TGF-β-smads通路作用的初步探討.pdf

1、增生性瘢痕是皮膚損傷后組織修復過程中出現(xiàn)的瘢痕組織過度增生性病變,瘢痕增生攣縮影響患者的外觀和功能,導致其生活質(zhì)量下降。其發(fā)病機制和病因目前尚未完全闡明,仍舊是整形科基礎研究的熱點之一。很多實驗己證明絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)應用于瘢痕疙瘩治療可收到良好的效果。
　　 轉化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是目前公認的與瘢痕疙瘩形成最為密切的細胞因子,研究表明,S

2、mad家族作為細胞質(zhì)內(nèi)TGF-β下游的信號轉導因子,在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展過程中起到關鍵作用。但針對絲裂霉素C經(jīng)由TGF-β/Smad信號通路作用于瘢痕疙瘩分子機制的報道較少。本實驗應用MTT法檢測MMC對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活性的影響,用Western blot和RT-PCR方法檢測MMC作用下瘢痕疙瘩成纖維細胞中Smads蛋白和TGF-β1mRNA的表達,探討MMC對TGF-β/Smad信號通路的作用機制,為治療瘢痕增生提

3、供一定的理論參考依據(jù)。
　　 目的:
　　 觀察MMC對TGF-β/Smad信號通路的作用,探討MMC治療瘢痕增生的作用機制。
　　 方法:
　　 1：應用手術中切取的瘢痕疙瘩組織作為體外原代和傳代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞的組織來源,細胞培養(yǎng)成功后,取3-6代生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。
　　 2：實驗分組及干預:分為正常對照組、不同濃度MMC干預組。MMC干預組分別用2.5μg/m

4、l、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的MMC處理細胞。正常對照組用10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞。
　　 3：采用四唑鹽比色(MTT)方法,觀察MMC對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活性的影響。
　　 4：采用RT-PCR方法,檢測MMC對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞TGF-β1mRNA表達的影響。
　　 5：采用Western blot技術檢測MMC作

5、用下,體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞中Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白的表達,觀察MMC對Smad表達的影響。
　　 6：數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行,采用單因素方差分析和LSD-t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1：體外瘢痕疙瘩成纖維細胞的形態(tài)學觀察
　　 體外瘢痕疙瘩成纖維細胞原代培養(yǎng)成功后,培養(yǎng)細胞呈梭形,細胞體積較大,胞質(zhì)向外伸出2-3個長短不同的偽

6、足,有一個較大的卵圓形核,細胞界限清楚,開始單個細胞一般鋪展很開,細胞間排列疏松,有較大的細胞間隙,隨后細胞增多,則細胞相互平行排列,成群細胞呈漩渦狀或放射行走。
　　 2：MMC對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活性的影響
　　 2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的絲裂霉素分別干預增生性瘢痕成纖維細胞24h,48h,72h,應用MTT法測定MMC對成纖維細胞生長的抑制率。2.

7、5μg/ml～200μg/ml時,2.5μg/ml的MMC即對細胞生長有明顯的抑制作用,這種抑制作用在200μg/ml時達到最大,顯示出明顯的劑量—效應依賴關系。在24h、48h、72h這3個時間段內(nèi),隨著培養(yǎng)時間的增加,細胞生長抑制率呈現(xiàn)上升趨勢,作用48h,72h,與24h相比,有極顯著差異(p＜0.01),作用72h與48h相比,但差異不顯著。
　　 3：不同濃度的MMC對TGF-β1 mRNA表達的影響
　　 3

8、.1：RNA提取后,經(jīng)Bio-mini測定,A260/A280均為1.8-2.0之間;瓊脂糖凝膠電泳顯示所提RNA完整,降解較少。表明RNA提取成功?？俁NA擴增產(chǎn)物電泳后背景清晰,未見電泳條帶,表明無基因組DNA的污染。
　　 3.2：TGF-β1 mRN,A RT-PCR.擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳為110bp的條帶,結果與預期一致,證明所擴增產(chǎn)物為目的片斷。
　　 3-3：TGF-β1與β-actin擴增產(chǎn)物均顯

9、示為清晰的條帶。計算每例TGF-β1與β-actin條帶光密度的比值作為TGF-β1 mRNA相對表達量。結果顯示,正常對照組,2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的絲裂霉素干預組的TGF-β1 mRNA相對表達量分別為0.88±0.08,0.80±0.07,0.51±0.05,0.47±0.05,0.36±0.04和0.22±0.02。MMC干預組TGF-β1 mRNA相對表達量明顯

10、低于正常對照組,從12.5μg/mlMMC開始具有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。隨MMC濃度增大,MMC干預組TGF-β1 mRNA相對表達量呈逐漸降低趨勢。
　　 4：蛋白免疫印跡檢測Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白的表達
　　 Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn):正常對照組及MMC2.5μg/ml～200μg/ml不同濃度組瘢痕疙瘩成纖維細胞中Smad2/3蛋白相對表達量分別為0.11±0.02,0.10

11、±0.04,0.10±0.02,0.08±0.02,0.06±0.01,0.05±0.02:Smad4蛋白相對表達量分別為0.34±0.04,0.40±0.03,0.36±0.08,0.33±0.10,0.36±0.03,0.39±0.03;Smad7蛋白相對表達量分別為0.04±0.01,0.06±0.02,0.10±0.03,0.18±0.08,0.21±0.10,0.36±0.17。與正常對照組相比,12.5μg/mlMMC開始對

12、瘢痕疙瘩成纖維細胞中Smad7蛋白的表達具有明顯增強效應(P＜0.05),50μg/ml MMC對Smad2/3蛋白的表達開始有減弱效應(P＜0.05),而對Smad4蛋白的表達無明顯變化。
　　 結論:
　　 1：2.5-200μg/ml范圍的MMC可有效抑制體外培養(yǎng)的病理性瘢痕成纖維細胞的增殖活性,當濃度為200μg/ml時作用尤為明顯。
　　 2： MMC對TGF-β1mRNA的表達具有明顯減弱效應;加入不