三七總甙對小鼠成體心肌干細胞體外轉分化的干預研究.pdf

1、目的：建立體外分離、培養(yǎng)、純化小鼠成體心肌干細胞的方法，鑒定心肌干細胞表面標記，探討其生物學特性，研究三七總甙對小鼠成體心肌干細胞體外轉分化的干預作用，為心肌梗死的心肌干細胞移植治療尋找切入點。
　　 方法：通過機械剪切和酶消化法從C57小鼠心臟中分離出單細胞懸液，置于含DMEM/Ham's F12，10％FBS，2％B27，10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF，10ng/mlCT-1，10ng/ml LIF，100

2、IU/ml青霉素，100μg/ml的自擬培養(yǎng)液中原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)后體外擴增，觀察細胞形態(tài)和生長。應用免疫磁珠法分選、純化出sca-1+細胞，流式細胞儀檢測細胞分選純度。體外培養(yǎng)擴增sca-1+細胞，記數(shù)并描繪細胞生長曲線。應用三七總甙(終末濃度為20μg/ml、40μg/ml、80ug/ml、160ug/ml)對sca-1+細胞進行分組誘導分化，5-氮胞苷(終末濃度為10μmol/L)為對照，分別誘導24h、3天、1周、2周，并設立空

3、白對照組。免疫熒光染色法檢測細胞表達心肌特異性抗體肌鈣蛋白T、連接蛋白43的陽性細胞比率(％)。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0版軟件進行統(tǒng)計學分析處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差(±s)％表示，采用單因素方差分析分別比較三七總甙與空白對照及5-氮胞苷誘導組之間的差異。P<0.05為差異，有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：相差顯微鏡下觀察從C57小鼠心臟組織中分離的細胞，可見散在體積小、圓形、折光性強的細胞，免疫磁珠法從傳代培養(yǎng)的細胞中分選、純化

4、出sca-1+細胞，流式細胞術檢測分選后細胞表達Sca-1陽性在87.4％，CD34陽性表達率為0.6％。應用10μmol/L的5-氮胞苷誘導組可以誘導純化后的心肌干細胞向心肌細胞分化，但1周后作用減退?？瞻讓φ战M兩周內(nèi)無誘導分化作用。三七總甙組可以誘導心肌干細胞向心肌細胞分化，且不同濃度誘導分化的效果不同，濃度小于40μg/ml三七總甙無明顯誘導分化作用；80ug/ml三七總甙組在三天、一周、兩周表達cTnT陽性率分別為(11.4±0

5、.82)％、(19.14±0.79)％、(20.21±0.84)％，表達connexin-43陽性細胞表達率分別為(10.23±1.35)％、(20.45±0.82)％、(21.78±0.92)％，相對5-氮胞苷誘導組的cTnT及connexin-43表達陽性率明顯增高，誘導24小時無統(tǒng)計學意義(P=0.78)，3天、7天、14天，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中80ug/ml三七總甙組表達率隨時間的延長，表達的陽性率增加，具有統(tǒng)

6、計學意義(P<0.05)。
　　 結論：從C57小鼠心臟組織可以分離出圓形、折光性強的小細胞，反復貼壁法難以達到富集心肌干細胞的目的。應用免疫磁珠法分選系統(tǒng)能夠分選、純化出高純度的sca-1+細胞，在自擬的心肌干細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)能夠不斷擴增，生長狀態(tài)良好，并保持未分化狀態(tài)。10μmol/L的5-氮胞苷可以誘導心肌干細胞向心肌細胞分化，誘導速度快，但持續(xù)時間短，可能是誘導心肌干細胞應采用小劑量的濃度。三七總甙可以誘導心肌干細胞向心