Smad2反義寡核苷酸對(duì)高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞分泌纖連蛋白，層粘連蛋白的影響.pdf

1、前言: 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的常見(jiàn)而嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的首要致病原因。DN的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，大量研究表明多種因素參與了其發(fā)生發(fā)展，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad信號(hào)通路在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TGF-β信號(hào)系統(tǒng)是細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的重要

2、調(diào)節(jié)劑，Smads蛋白是TGF-β信號(hào)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在TGF-β的刺激下Smads蛋白在核內(nèi)積聚調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad 2是Smads蛋白家族成員之一，它是TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)特有的作用底物，因此Smad2與TGF-β受體短暫的結(jié)合和磷酸化是Smad復(fù)合體在細(xì)胞核內(nèi)蓄積所必須，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的始動(dòng)因子。 DN主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，DM的高糖狀態(tài)下TGF-β1系統(tǒng)激活，Smad2蛋白可通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-

3、β信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成與沉積，使系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。 纖連蛋白(fibronection，F(xiàn)N)和層粘連蛋白(lamimin，LN)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給體外常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染Smad2反義寡核苷酸(oligodeoxynudeotides,ODN),直接抑制Smad2基因的激活，觀察其對(duì)FN，LN分

4、泌的影響，探討Smad2在糖尿病腎病中的作用，尋找延緩腎小球硬化的新途徑。 研究對(duì)象與方法: 1、材料細(xì)胞：人腎小球系膜細(xì)胞(美國(guó)ScienCell Research Laboratory，編號(hào)4200)試劑：細(xì)胞完全培養(yǎng)基(美國(guó)ScienCell Research Laboratory，編號(hào)4201)，Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen Life Technologies)，Smad2正義、

5、反義寡核苷酸。(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，F(xiàn)N,LN ELISA試劑盒(上海森雄公司)。 儀器：冰箱，離心機(jī)，恒溫箱，顯微鏡，熒光顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)臺(tái)等。 2、實(shí)驗(yàn)方法 常規(guī)培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，傳代至5～8代用于實(shí)驗(yàn)，給予轉(zhuǎn)染不同劑量及比率的寡核苷酸和脂質(zhì)體,觀察轉(zhuǎn)染效率。此后實(shí)驗(yàn)選用最佳轉(zhuǎn)染效率組轉(zhuǎn)染。 取常規(guī)培養(yǎng)傳代至5～8代人腎小球系膜細(xì)胞，分為六組：①高糖組：葡萄糖30mmol/L，

6、②轉(zhuǎn)染Smad2反義ODN組：葡萄糖30mmol/L Smad2反義ODN0.81μg,Lipofectamine 2000 2.0μl，⑧轉(zhuǎn)染Smad2正義ODN組：葡萄糖30mmol/L，Srnad2正義ODN0.8μg,Lipofectamine 2000 2.0μl，④脂質(zhì)體組：葡萄糖30mmol/L，Lipofectamine 2000 2.0μl，⑤正常糖組：葡萄糖5.0mmol/L，⑥甘露醇組：甘露醇25mmol/L.葡萄

7、糖5.0mmol/L。分別取0h、18h、24h、48h、72h培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)FN，LN含量。 結(jié)果: 通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)ODN的轉(zhuǎn)染效率因ODN和Lipofectamine 2000的劑量和比率不同而不同，其中ODN：Lipofectamine 2000=0.8μg：2.0μl=1：2.5轉(zhuǎn)染率最高。人腎小球系膜細(xì)胞經(jīng)高糖培養(yǎng)后LN和FN分泌較正常糖組明顯增加，轉(zhuǎn)染反義ODN組LN和FN分泌明顯減少,轉(zhuǎn)染正

8、義ODN組LN和FN分泌無(wú)明顯減少，甘露醇組與正常糖組相比LN和FN分泌相似,脂質(zhì)體組與高糖組LN和FN分泌分泌相似。 結(jié)論: 高糖刺激人腎小球系膜細(xì)胞能增加其細(xì)胞外基質(zhì)FN和LN的合成和分泌，而Smad2反義ODN能抑制PN和LN的分泌，Smad2正義ODN不能抑制PN和LN的分泌,脂質(zhì)體在其中起到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ODN的作用，而對(duì)FN和LN的分泌無(wú)抑制作用，甘露醇組與高糖組的滲透壓相同，而不引起FN和LN分泌增加，說(shuō)明刺激人