miRNAs對斷奶仔豬大腸桿菌抗性的調控作用及機制分析.pdf

1、斷奶仔豬腹瀉和水腫病是導致斷奶仔豬死亡的重要傳染性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，E.coliF18菌株是引起這兩種疾病的主要病原菌。由于中國地方豬種抗E.coliF18分子機制尚不清楚，本研究從microRNA及其靶基因的調控作用入手，首先基于課題組前期在蘇太豬（具有太湖豬和杜洛克血統(tǒng)的培育品種）F18大腸桿菌抗性型和敏感型個體microRNA測序篩選出的重要的microRNA—miR-192，利用靶基因預測、qPCR、雙熒光素酶

2、報告檢測、細胞水平的細菌感染刺激、TALEN敲除以及microRNA前體SNP檢測等一系列基因功能驗證技術，系統(tǒng)分析miR-192及其靶基因的作用，以期進一步揭示microRNAs在斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性的調控機制。主要試驗結果如下:
　　(1)一種高效準確的大腸桿菌對腸上皮細胞黏附水平的檢測方法有助于大腸桿菌抗性相關miRNA及其靶基因的功能研究，本研究應用實時熒光定量PCR方法，以大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac

3、菌毛蛋白基因和豬β-ACTIN基因設計定量PCR引物，以大腸桿菌和豬腸上皮細胞系(IPEC-J2)總DNA為模板進行相對定量PCR檢測，利用2-ΔΔct計算不同細胞培養(yǎng)面積孔板中細菌相對細胞黏附數量。結果顯示，6孔板、12孔板和24孔板培養(yǎng)面積的豬腸上皮細胞分別對F18ab、F18ac和K88ac大腸桿菌的相對黏附數量均差異不顯著，大腸桿菌相對黏附數量不受細胞培養(yǎng)數量的影響，結果表明所建立的方法能夠準確檢測大腸桿菌相對黏附數量，為本研究

4、中大腸桿菌黏附相關實驗提供了便捷可靠的檢測方法。
　　(2)miR-192靶基因的生物信息分析結合前期表達譜芯片結果，獲得5個重要的靶基因，分別是DLG5、ALCAM、 FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3，結合基因生物學功能和文獻挖掘的結果，將ALCAM和DLG5基因確定為關鍵靶基因進行相關功能研究。通過構建關鍵靶基因非編碼區(qū)的熒光素酶報告重組載體，與miRNA模擬物(mimics)共轉染293細胞，在細胞水平分析驗證miR-

5、192對于關鍵靶基因的靶向作用，熒光素酶活性檢測結果顯示，miR-192 mimics對ALCAM和DLG5基因均表現為抑制作用(P＜0.05)。
　　(3)關鍵靶基因ALCAM和DLG5的表達譜分析結果表明，DLG5基因在蘇太豬35日齡斷奶仔豬抗性型和敏感型個體的空腸、十二指腸、肝臟、肺、腎等組織中高度表達，抗性型個體的相對表達量高于敏感型個體，且在心臟和淋巴組織中達到顯著水平(P＜0.05)，在所有組織中抗性型和敏感型個體表達

6、水平的差異倍數為1.049～6.464; ALCAM基因在蘇太豬的肝臟、肺、腎組織中高度表達，在胃、淋巴、十二指腸和空腸組織中度表達，在其他組織中表達量相對較低，且抗性型和敏感型個體各組織組間差異均不顯著。在蘇太豬從初生到斷奶不同發(fā)育時期（8日齡、18日齡、28日齡和35日齡）的表達差異分析結果表明，DLG5基因在肌肉、肺臟及免疫（胸腺、淋巴和脾臟）等組織中隨日齡增加表達降低，十二指腸和空腸組織中在28日齡的表達量降至最低，35日齡時呈

7、上升趨勢。ALCAM基因28日齡腎臟組織中表達量顯著高于8日齡(P＜0.05);28日齡和35日齡十二指腸組織的表達量顯著低于18日齡，呈下調趨勢(P＜0.05)。
　　(4)在豬小腸上皮細胞系IPEC-J2中分析F18ab、F18ac和K88ac侵襲對miR-192及其關鍵靶基因表達的影響，細菌刺激未對miR-192的轉錄水平產生顯著影響，細菌培養(yǎng)上清刺激也沒有引起miR-192轉錄水平的顯著變化，且不隨刺激時間表現出變化趨勢;

8、細菌刺激引起了DLG5和ALCAM基因轉錄水平顯著下調(P＜0.05)，細菌培養(yǎng)上清刺激也能引起DLG5和ALCAM基因轉錄水平下調，且隨著刺激時間的延長，DLG5和ALCAM基因的轉錄水平表達呈顯著下調趨勢(P＜0.05)。
　　(5)利用TALEN載體介導敲除IPEC-J2細胞miR-192成熟體，獲得miR-192成熟體序列缺失的細胞株，對細胞株中重要靶基因表達水平的檢測結果表明，miR-192敲除細胞和對照組的DLG5、A

9、LCAM、FRMD4B的表達水平差異不顯著，而MIPOL1和ZFHX3在敲除細胞中的表達水平表現為顯著下調(P＜0.05)，大腸桿菌黏附水平檢測結果顯示，miR-192敲除細胞對大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac的黏附能力均表現為顯著上升(P＜0.05)。
　　鑒于蘇太豬同時具有外來品種和中國地方豬品種的遺傳基礎，關于蘇太豬microRNAs的研究并不能完全代表和揭示中國地方豬品種斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性的調控機制。因此

10、，本研究又以中國地方豬品種梅山豬為研究對象，利用E.coli F18菌株對梅山斷奶仔豬進行大腸桿菌感染試驗，并通過細菌數量檢測、小腸上皮細胞體外黏附及病理檢測等一系列試驗對大腸桿菌感染試驗的表型結果進行系統(tǒng)的驗證，獲得了確證的E.coli F18抗性型和敏感型個體，然后利用Selex高通量測序，篩選梅山豬斷奶仔豬抗性型和敏感型個體間差異microRNAs，通過靶基因預測、網絡互作圖構建等生物信息學手段，結合課題組前期轉錄組測序結果，篩選

11、出重要的靶基因及其調控通路，同時利用RNAi技術和細菌感染在細胞水平上進一步驗證重要靶基因及其通路基因對大腸桿菌感染的調控作用，探討中國地方斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性相關的microRNA分子及其關鍵靶基因的功能及其調控機制。主要試驗結果如下:
　　(1)對蘇太豬中發(fā)揮重要調控作用的miR-192在梅山豬中進行初步的功能分析驗證，組織表達譜結果顯示，miR-192在十二指腸和空腸組織中均具有較高水平的表達，肝和腎中度表達，在心、脾

12、、肺、胃、肌肉、胸腺和淋巴中表達量較低。結合前期梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌試驗的結果，大腸桿菌處理沒有造成十二指腸和空腸組織中miR-192表達水平的顯著性變化，miR-192可能并沒有在梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌感染過程中發(fā)揮重要的調控作用。
　　(2)利用前期通過大腸桿菌感染試驗和一系列驗證獲得的確證的梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個體，對其十二指腸組織進行microRNA高通量測序分析，獲得梅山豬抗性型和敏感型全同胞個體

13、差異miRNAs24個，其中上調15個，下調9個;通過qPCR方法檢測驗證miRNAs的差異倍數，發(fā)現其與高通量篩選結果具有較高的一致性;結合課題組前期梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個體的轉錄組結果以及差異miRNAs的實驗驗證結果，并通過靶基因互作網絡的分析，將miR-7136-5p及其靶基因MyD88基因確定為關鍵microRNA和關鍵靶基因，鑒于MyD88是TLRs/IL-1R信號通路中重要的接頭蛋白，將其所在TLR4

14、信號通路作為本試驗重點研究的關鍵調控通路，分析其在大腸桿菌感染中的作用及其機制。
　　(3)F18ac和K88ac菌體刺激后，豬小腸上皮細胞系IPEC-J2的MyD88轉錄水平顯著下調，其所在的TLR4通路中TNFα基因轉錄水平極顯著上調(P＜0.01)。細菌培養(yǎng)液上清刺激后，MyD88基因在8小時后急劇下調，TNFα基因轉錄水平顯著上調(P＜0.05)。受大腸桿菌F18ac和K88ac刺激后，PK15細胞的MyD88同樣顯著下調

15、(P＜0.05);F18ac使TLR4通路中CD14基因的表達極顯著上調(P＜0.01)，而K88ac的刺激未顯著改變其表達;IFN-α表達變化不顯著，K88ac刺激使TLR4通路中IL-1β和TLR4基因輕度上調，TNF-α基因水平極顯著上調(P＜0.01)。細菌培養(yǎng)上清液同樣使PK15細胞MyD88基因整體表現下調;CD14基因整體為下調;IFN-α表現為下調;IL-1β和TLR4基因整體趨勢為上調;F18ac上清處理組TNF-α表

16、現為極顯著水平的上調(P＜0.01)，而K88ac上清處理組TNF-α未表現出上調趨勢。
　　(4)利用RNAi技術獲得干擾豬MyD88基因效率最高的shRNA表達載體，將其包裝成慢病毒載體，用于建立MyD88基因穩(wěn)定沉默的細胞系，最終獲得MyD88基因的干擾效率分別為69.3％、61.0％的IPEC-J2和PK15細胞。MyD88基因的下調造成PK15細胞TLR4和IL-1β基因表達水平顯著下調(P＜0.05)，而CD14、IF

17、N-α和TNF-α基因表達水平未發(fā)生顯著變化。RNAi MyD88基因未對細胞培養(yǎng)液上清中細胞因子IL-1β和TNF-α的水平造成顯著影響。
　　本研究結果表明，microRNA在蘇太豬和梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌感染過程中均發(fā)揮了重要的調控作用，而且進一步提示梅山豬（中國地方豬品種）和蘇太豬（含有外來豬品種血統(tǒng)的培育品種）在大腸桿菌病抗性的遺傳基礎和調控機制方面確實存在差異。miR-192靶向作用DLG5和ALCAM基因在蘇太豬斷奶