高遷移率族蛋白B1(HMGB1)通過(guò)miR-21依賴(lài)的途徑在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）是一種復(fù)雜的高度惡性的慢性肝臟疾病，由于缺乏及時(shí)有效的診斷及治療，使其成為世界范圍內(nèi)癌癥死亡的第三大原因。盡管近年來(lái)涌現(xiàn)出許多新的治療手段，但腫瘤細(xì)胞在肝臟內(nèi)外的轉(zhuǎn)移及侵襲仍然是病人死亡的主要原因。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)，不僅是一種高度保守的細(xì)胞核蛋白，在核內(nèi)促進(jìn)多種基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也是一種細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)分子，由壞死的細(xì)胞或者炎癥細(xì)胞分泌釋放。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)過(guò)程中

2、都發(fā)揮著重要作用。作為唯一一個(gè)在絕大部分癌癥中都過(guò)表達(dá)的miRNA,miR-21被認(rèn)為是一種致癌微小RNA（oncomir)。雖然HMGB1與miR-21這兩種致癌基因的過(guò)表達(dá)在多種癌癥中已分別被廣泛報(bào)道，但二者之間的關(guān)系及一些共同通路卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題旨在研究肝癌中異常表達(dá)的HMGB1對(duì)在多數(shù)癌癥中高表達(dá)的miR-21的正向調(diào)控作用，來(lái)闡述肝細(xì)胞癌形成后進(jìn)展的潛在的分子生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而為肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的預(yù)防和治療提供新的策略。
　

3、　方法：利用肝癌細(xì)胞與重組人HMGB1蛋白的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，確定了外源性HMGB1對(duì)肝癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)的時(shí)間及劑量依賴(lài)性。通過(guò)HMGB1中和抗體，IL6,IL6R及stat3抑制實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)miR-21的表達(dá)，stat3的活化，IL6的釋放，包括Western blot，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)stat3以及stat3磷酸化位點(diǎn)tyr705的表達(dá)及轉(zhuǎn)位、Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL6在細(xì)胞培養(yǎng)液的釋放等方法，進(jìn)一步驗(yàn)證了HMGB1對(duì)miR-21表達(dá)

4、調(diào)控對(duì)IL6/stat3通路的依賴(lài)性。通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站（TargetScan,miRBase及PicTar等網(wǎng)站）的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)，Luciferase熒光素酶精確靶點(diǎn)驗(yàn)證，Westernblot分析，SYBR Green定量PCR等實(shí)驗(yàn)方法，從多方面證實(shí)了miR-21對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）抑制劑的負(fù)向調(diào)控。最后，采用肝細(xì)胞癌裸鼠移植瘤模型，在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)，阻斷miR-21對(duì)HMGB1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展的抑制作用。

5、r>　　結(jié)果：在肝癌細(xì)胞中外源性人重組HMGB1可通過(guò)上調(diào)miR-21的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)及進(jìn)展。其對(duì)miR-21表達(dá)的調(diào)控表現(xiàn)為劑量和時(shí)間的依賴(lài)性，分別設(shè)置0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml不同的劑量濃度，隨著劑量的增加，miR-21的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，選擇1ug/ml作為最佳刺激濃度，分別與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)不同的時(shí)間長(zhǎng)度：0h，1h，3h，6h，12h，24h，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-21的表達(dá)升高，在24h時(shí)達(dá)到最

6、高。通過(guò)加入HMGB1，IL6及IL6R中和抗體，和stat3抑制劑，證明HMGB1對(duì)miR-21表達(dá)的調(diào)控是IL6/stat3通路依賴(lài)性的。即在肝癌細(xì)胞中，外源性HMGB1對(duì)miR-21表達(dá)的刺激不是直接作用的，而是通過(guò)一些相關(guān)的信號(hào)通路介導(dǎo)的相關(guān)的炎癥通路調(diào)控的。在本課題中，通過(guò)精確靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（即luciferase assay）證實(shí)，通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)RECCK和TIMP33’UTR區(qū)域的直接綁定，miR-21可以對(duì)二者進(jìn)行負(fù)性調(diào)控

7、在HMGB1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，抑制miR-21的表達(dá)，或者利用stat3抑制劑與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，均可以在很大程度上抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，在HMGB1過(guò)表達(dá)的裸鼠肝癌移植瘤模型中，細(xì)胞成瘤的速度及腫瘤的大小明顯高于對(duì)照組，瘤內(nèi)注射miR-21抑制劑，腫瘤的大小明顯減小，生長(zhǎng)的速度明顯減慢，活體成像實(shí)驗(yàn)表明，miR-21抑制劑的瘤內(nèi)注射，使HMGB1過(guò)表達(dá)組的MMPs活性明顯降低，進(jìn)而抑制肝癌的進(jìn)展。
　　結(jié)論

8、：體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都提示，HMGB1對(duì)miR-21表達(dá)的調(diào)控是IL6/stat3通路依賴(lài)性的，并且miR-21是HMGB1下游一個(gè)重要的分子，在HMGB1過(guò)表達(dá)引起的腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。MiR-21抑制劑通過(guò)靶向關(guān)鍵性MMPs抑制劑RECK和TIMP3，抑制了MMPs的活性表達(dá)，進(jìn)而抑制HMGB1誘導(dǎo)的肝癌的發(fā)生發(fā)展。研究提示，通過(guò)對(duì)miR-21的調(diào)控來(lái)干預(yù)HMGB1過(guò)表達(dá)引起的腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展有望成為一種潛在的抗肝癌