ICAM-5通過ERM-PI3K-Akt信號途徑減輕Aβ誘導的神經(jīng)變性.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的典型神經(jīng)病理特征是患者腦內(nèi)出現(xiàn)以β-淀粉樣蛋白(amyloid beta peptide，Aβ)為主要成分的神經(jīng)元外老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibilllary tangles，NFTs)、廣泛的神經(jīng)元變性消失。神經(jīng)元變性凋亡涉及信號轉(zhuǎn)導、基因調(diào)控和凋亡效應等三個階段。信號轉(zhuǎn)導過程的激活是啟動細胞變性凋亡的必要前提，從而調(diào)

2、控細胞存活與死亡。神經(jīng)元變性凋亡的發(fā)生機制主要涉及兩條信號轉(zhuǎn)導通路，即線粒體通路和膜死亡受體通路。二者最后都啟動caspase的級聯(lián)反應而引起神經(jīng)元凋亡。此外，細胞周期異常也可以影響到神經(jīng)元的存活。神經(jīng)元內(nèi)外存在著在各種致凋亡因素，同時也存在著抗凋亡的相關(guān)信號途徑，其中經(jīng)典的抗凋亡信號途徑是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路。 細胞間黏附分子

3、5(Intercellular adhesion molecule-5，ICAM-5，telencephalin)是一種在哺育動物端腦神經(jīng)元體樹突膜特異性表達的復雜黏附分子，具有促進神經(jīng)元樹突生長與影響學習記憶功能的作用。ICAM-5的胞質(zhì)區(qū)結(jié)合于埃茲蛋白.根蛋白.膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)家族蛋白使膜蛋白與細胞骨架肌動蛋白連接起來，而ERM的磷酸化活性形式可以啟動PI3K/Akt信號通路。因此，ICA

4、M-5可能通過激活ERM蛋白而啟動PI3K/Akt信號通路。但其是否可以對抗Aβ的神經(jīng)毒性或參與信號傳導，目前國內(nèi)外無這方面的報道。 研究目的：探索ICAM-5是否減輕或緩解Ap的神經(jīng)毒性作用和激活抗凋亡的PI3K/Akt信號通路來阻斷Aβ誘導的凋亡信號傳導，為AD和其他神經(jīng)變性疾病的防治提供相關(guān)基礎。 研究方法：1.建立神經(jīng)元模型：用常表達人野生型ICAM-5蛋白的人神經(jīng)母細胞瘤細胞PAJU-ICAM-5進行連續(xù)不加壓

5、傳代，使其質(zhì)粒脫失，經(jīng)免疫熒光和Western Blot鑒定為PAJU細胞后轉(zhuǎn)染含NEO抗性基因的空載體，建立空載體轉(zhuǎn)染的對照細胞模型PAlU-NEO；2.用Aβ作為神經(jīng)毒性刺激物，分別對PAJU-ICAM-5和PAJU-NEO細胞進行不同濃度和時間段刺激，采用MTT法檢測神經(jīng)元活力、Hoechst33258神經(jīng)元核染色觀察核凋亡、流式細胞儀檢測神經(jīng)元凋亡，以了解ICAM-5是否具有保護神經(jīng)元對抗Aβ的整體作用；同時用蛋白免疫印跡技術(shù)檢

6、測Aβ對ICAM-5表達的影響；3.測量在不同濃度和時間段Aβ作用下的神經(jīng)突起，并使用免疫熒光染色，觀察Aβ對神經(jīng)突起末梢的影響，以了解CAM-5表達是否具有保護神經(jīng)突起對Aβ的局部作用；4.采用免疫印跡技術(shù)檢測Aβ刺激作用后磷酸化蛋白的表達，以了解抗凋亡變性信號途徑是否被激活。 研究結(jié)果：1.PAJU-ICAM-5細胞經(jīng)不加壓連續(xù)傳代10代后出現(xiàn)質(zhì)粒完全脫失，經(jīng)過免疫熒光檢測和Western Blot驗證無ICAM-5表達；空

7、載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的PAJU-NEO細胞株建立。2.ICAM-5蛋白常量穩(wěn)定表達于PAlU細胞后，可減輕Aβ誘導的PAJU細胞凋亡變性，表現(xiàn)為細胞存活率升高和凋亡率降低。同時，表達于PAJU細胞中的ICAM-5蛋白在經(jīng)受長時間高濃度Aβ42作用后出現(xiàn)降低趨勢。3.PAJU-ICAM-5細胞突起分支長度損傷較PAJU-NEO細胞明顯減輕。4.通過免疫印記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ICAM-5蛋白的表達使Moesin蛋白的558位蘇氨酸(Thr558

8、)殘基磷酸化而形成活化狀態(tài)，經(jīng)Aβ刺激后引起其家族蛋白中的Ezfin蛋白的第567位蘇氨殘基酸(Thr567)和Radixin蛋白的564位蘇氨酸(Thr564)出現(xiàn)磷酸化激活，并由此導致了PI3K蛋白調(diào)節(jié)亞單位p85α的508位酪氨酸殘基(Tyr508，p85α)磷酸化，引起PI3K活化，PI3K直接促使Akt蛋白的473位絲氨酸(Ser-473)殘基磷酸化而激活了信號通路。5.PI3K特異性抑制劑LY294002不僅下調(diào)PI3K蛋白

9、表達，而且還可以下調(diào)ICAM-5、磷酸化ERM、磷酸化PI3K及磷酸化Akt蛋白的表達，而總ERM、總PI3K及總Akt卻表達于未經(jīng)LY294002和Aβ處理以及經(jīng)過LY294002和Aβ處理過的PAJU細胞。提示LY294002可能是這條信號通路上的生物學調(diào)節(jié)標志。 研究結(jié)論：1.我們首次證明了ICAM-5蛋白常表達具有神經(jīng)保護作用，可以減輕Aβ神經(jīng)毒性所致的PAJU細胞凋亡及神經(jīng)突起變性。2.Aβ42與ICAM-5之間具有相