間隙蛋白43和E-鈣粘蛋白在肺癌中的表達及臨床意義.pdf

1、背景和目的：
　　細胞間的間隙連接通訊在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面具有重要效應，而上皮細胞間粘附連結與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關，其中，間隙連接蛋白(Connexin，Cx)在細胞間的間隙連接通訊上，E-鈣粘蛋白（E-cadherin/E-CD）在上皮細胞間粘附連結上發(fā)揮著重要作用。
　　Cx是一種構成細胞間連接方式的蛋白，控制著特異細胞的生長、發(fā)育、新陳代謝、增值和分化等，多種腫瘤間隙連接結構或功能的改變與Cx表達相關，Cx基因表達對

2、大多數(shù)腫瘤的生長起到負性調(diào)節(jié)作用，因此Cx被認為是潛在的非突變型抑癌因子。
　　E-鈣粘蛋白是一種鈣依賴性細胞粘附分子，是上皮細胞的極性及細胞間粘附連結的主要分子，介導上皮細胞之間的粘附，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，E-鈣粘蛋白可以阻止腫瘤細胞脫離原發(fā)的病灶，E-鈣粘蛋白表達與上皮性腫瘤的侵襲、復發(fā)和轉(zhuǎn)移有關，因此E-鈣粘蛋白被認為是重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。
　　肺癌(Lungcancer)是原發(fā)性支氣管肺癌(Primarya

3、rybronchogeniccarcinoma)簡稱，是一種常見的肺部惡性腫瘤，絕大多數(shù)起源于支氣管粘膜上皮，常有區(qū)域性淋巴轉(zhuǎn)移、血行播散和經(jīng)支氣管擴散?？梢酝茰yCx和E-鈣粘蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能起著一定作用，目前已有的研究尚不完善，缺乏這方面系統(tǒng)的臨床研究和基礎研究。為此，本研究分三個部分系統(tǒng)探索和分析肺癌發(fā)生發(fā)展中Cx43和E-鈣粘蛋白的作用和臨床意義。
　　第一部分間隙蛋白43在肺癌中的表達及臨床意義
　　方法：<

4、br>　　收集未接受過放化療以及病理證實為肺癌的手術組織標本50例，對照取自癌旁組織3cm以上的正常肺組織。采用常規(guī)組織學進行形態(tài)學觀察;采用免疫組織化學進行Cx43蛋白表達進行檢測;采用RT-PCR方法進行Cx43mRNA表達進行檢測;并與臨床資料進行比分析。數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、50例病例中，根據(jù)按UICC標準判定TNMF分期:Ⅰ期12例，Ⅱ期1

5、5例，Ⅲ期19例，Ⅴ期4例;組織學分型:腺癌24例，鱗癌19例，大細胞未分化癌7例;病理分級:高分化10例，中分化20例，低分化20例;其中伴淋巴結轉(zhuǎn)移者32例。
　　2、Cx43蛋白經(jīng)IHC檢測顯示，Cx43蛋白呈現(xiàn)棕黃色染色顆粒分布于細胞漿中為陽性表達。在正常肺組織中的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞均呈陽性高表達;隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，Cx43蛋白表達逐漸降低，在Ⅲ，Ⅳ期非小細胞肺癌中陽性表達率明顯低于Ⅰ，Ⅱ期;低分化的肺癌陽性表達

6、率明顯低于中、高分化的肺癌，Cx43表達與肺癌淋巴結轉(zhuǎn)移具有相關性。Cx43在鱗癌和大細胞未分化癌陽性表達率明顯低于肺腺癌組織中陽性表達。
　　3、正常肺組織、癌旁組織和中肺癌組織中Cx43mRNA相對表達量分別為58.66±8.1、42.09±2.7和36.05±3.1，肺癌組織中Cx43mRNA相對表達量與正常肺組織、癌旁組織比較顯著降低，差異均有非常顯著性(P＜0.05)。Cx43mRNA也與患者的組織學類型、臨床分期和淋巴

7、結轉(zhuǎn)移相關。
　　第二部分E-鈣粘蛋白在肺癌中的表達及臨床意義
　　方法：
　　收集未接受過放化療以及病理證實為肺癌的手術組織標本50例，對照取自癌旁組織3cm以上的正常肺組織。采用常規(guī)HE染色進行組織學形態(tài)學觀察;石蠟切片，利用免疫組織化學方法檢測E-鈣粘蛋白表達;提取mRNA，以Oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用PCR方法檢測E-鈣粘蛋白mRNA表達;并與臨床資料進行比分析。數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進

8、行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、E-鈣粘蛋白免疫組織化學方法檢測顯示，在正常肺組織中的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和癌旁組織中均呈陽性表達。Ⅰ～Ⅱ期肺癌組織中E-cadherin陽性率59.26％，Ⅲ～Ⅴ期陽性率為21.74％，差異有非常顯著性(P＜0.05)。高、中分化肺癌組織中E-cadherin陽性率56.67％，低分化期陽性率為20.00％，差異有非常顯著性(P＜0.05)。E-c

9、adherin陽性表達與患者的組織學類型和臨床分期及淋巴結轉(zhuǎn)移相關。
　　2、正常肺組織、高、中分化肺鱗癌組織和低分化肺鱗癌組織中E-cadherinmRNA相對表達量分別為56.7±4.26、27.2±10.2和4.3±3.0，高、中分化肺鱗癌組織和低分化肺鱗癌組織中E-cadherinmRNA相對表達量與正常肺組織比較均顯著降低，差異均有非常顯著性(P＜0.05)。E-cadherinmRNA也與患者的組織學類型和淋巴結轉(zhuǎn)移相

10、關。
　　第三部分上調(diào)E-鈣粘蛋白基因表達對肺癌細胞A549生物學行為的影響
　　方法：
　　以含有E-cadherin基因全長cDNA的質(zhì)粒pUC57-E-cadherin為模板，PCR擴增出E-cadherin基因;HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后重組入真核表達載體pcDNA3.1(+)，經(jīng)過序列分析鑒定得到E-cadherin重組表達載體pcDNA3.1(+)-E-cadherin。使用BTX將pcDNA3.1(+)

11、-E-cadherin電轉(zhuǎn)入肺癌細胞A549，篩選培養(yǎng)得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。RT-PCR和Western-blot方法分別檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞E-cadherinmRNA和蛋白表達水平。細胞增殖和軟瓊脂集落形成實驗檢測高表達E-cadherin對肺癌細胞生長的影響;劃痕實驗和細胞體外侵襲實驗檢測高表達E-cadherin對肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響;流式細胞術檢測高表達E-cadherin對肺癌細胞凋亡的影響。
　　結果：
　　1、得到246

12、6bp的目的基因E-cadherin擴增片段，與預測一致。HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定和測序鑒定得到E-cadherin重組表達載體pcDNA3.1(+)-E-cadherin。
　　2、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-E-cadherin的E-cadherin組與兩個對照組細胞E-cadherinmRNA相對表達量比較，均顯著升高，差異有非常顯著性(p＜0.01，F(xiàn)=757.74)，說明構建的重組E-cadherin載體(pcDN

13、A3.1(+)-E-cadherin)轉(zhuǎn)染A549細胞后，能高效表達E-cadherinmRNA。
　　3、pcDNA3.1(+)-E-cadherin的E-cadherin組與兩個對照組細胞E-cadherin免疫印跡條帶光密度比較顯著升高，差異有非常顯著性(p＜0.01)。與RT-PCR檢測結果一致。
　　4、E-cadherin組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-E-cadherin的A549細胞）細胞的吸光度值與二個對照

14、組比較，在2d、3d、4d、5d均顯示降低，差異有顯著性(p＜0.05)
　　5、E-cadherin組與二個對照組（表達載體對照組和空白對照組）比較，軟瓊脂集落形成數(shù)顯著減少，差異有非常顯著性(P＜0.01)。
　　6、空白對照組與表達載體對照組細胞劃痕修復速度一致，二者與E-cadherin組細胞劃痕修復速度比均顯示修復較快。
　　7、E-cadherin組與二個對照組（表達載體對照組和空白對照組）比較，穿透Mat

15、rigel的平均細胞數(shù)顯著減少，差異有非常顯著性(P＜0.01)。
　　8、空白對照組、表達載體對照組和E-cadherin組凋亡率比較，差異均無顯著性(p＞0.05)。
　　結論：
　　1、在正常肺組織中的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞Cx43基因均呈陽性高表達;隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，Cx43蛋白表達逐漸降低，在Ⅲ，Ⅳ期非小細胞肺癌中陽性表達率明顯低于Ⅰ，Ⅱ期;低分化的肺癌陽性表達率明顯低于中、高分化的肺癌，Cx43表達與

16、肺癌有無淋巴結轉(zhuǎn)移無明顯相關性。
　　2、E-cadherin基因在正常肺組織中的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和癌旁組織中均呈陽性表達。隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，E-cadherin表達逐漸降低，在Ⅲ，Ⅳ期非小細胞肺癌中陽性表達率明顯低于Ⅰ，Ⅱ期;低分化的肺癌陽性表達率明顯低于中、高分化的肺癌，E-cadherin表達與淋巴結轉(zhuǎn)移相關。
　　3、構建E-cadherin重組表達載體pcDNA3.1(+)-E-cadherin，并得到