IBV感染雞腎臟和脾臟轉錄組學分析及雞IFITM1抑制IBV和NDV復制機制的研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)和新城疫病毒(NDV)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原，二者引起急性、高度傳染性禽呼吸道疾病，威脅著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。
　　本研究通過轉錄組學分析了IBV感染后宿主脾臟和腎臟中全基因的差異表達情況，借以嘗試揭示IBV的致病機制和宿主的抗病毒機制。我們比較分析了IBV感染早期和晚期脾臟基因差異表達情況。結果表明脾臟作為重要免疫器官參與了宿主對IBV的免疫反應，在IBV感染早期激發(fā)的免疫反應要強于感染晚期，IBV感染晚

2、期誘導的炎癥反應要強于感染早期。在IBV感染致死雞的腎臟中共有1777個差異表達基因;其中包括干擾素誘導跨膜蛋白1(IFITM1)在內(nèi)的103個免疫和炎癥相關基因顯著差異表達這103個免疫和炎癥相關基因能夠組成一個以IL6，STAT1，MYD88，IRF1和NFKB2為中心的相互作用網(wǎng)絡。提示這些基因可能在宿主抵抗IBV感染過程中發(fā)揮重要作用。對差異表達基因進行生物信息學分析，結果顯示差異表達基因主要參與信號轉導、細胞粘附、能量代謝、細

3、胞因子通路、免疫反應、凋亡調(diào)節(jié)等生物進程。我們首次對IBV感染雞的腎臟和脾臟進行轉錄組學分析，研究結果為進一步深入了解宿主的抗病毒機制和IBV的致病機制提供了素材。
　　IFITM是一類重要的抗病毒因子，我們在進行轉錄組學分析時發(fā)現(xiàn)chIFITM1(LOC422993)在IBV感染的腎臟中顯著上調(diào)表達。人源和鼠源IFITM蛋白通過定位在細胞膜或細胞內(nèi)體膜上限制SARS-CoV、流感病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒等多種病毒的侵入

4、，但雞源IFITM1(chIFITM1)在病毒感染中的潛在作用尚未見報道。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)GenBank中標注為IFITM3的基因(LOC422993)含有IFITM家族特有的CD225保守結構域，因此LOC422993屬于IFITM家族;但LOC422993缺失YXXΦ氨基酸基序，YXXΦ氨基酸基序的缺失是人源、鼠源、豬源IFITM1蛋白的共性，因此我們認為LOC422993為雞源IFITM1而非IFITM3。通過熒光定量RT-

5、PCR檢測chIFITM1基因的體內(nèi)外分布情況時發(fā)現(xiàn)該基因在各組織分布差別很大，腎臟、氣管和肺臟在轉錄水平幾乎檢測不到chIFITM1的表達，只有個別雞檢測到低拷貝表達;脾臟、胸腺和腺胃的表達量也較低，而消化道、法氏囊、肝臟和胰腺的表達量較高。同時體外培養(yǎng)的DF1和LMH細胞在轉錄水平檢測不到chIFITM1的表達;CEF細胞中有微弱表達，推測可能是在制備細胞過程中腸道等chIFITM1高表達組織未能完全去除所致。
　　進一步研究

6、發(fā)現(xiàn)在IBV感染致死雞的靶器官氣管和腎臟中chIFITM1 mRNA顯著上調(diào)表達，其中在腎臟中的上調(diào)倍數(shù)高于氣管中的上調(diào)倍數(shù)，chIFITM1在其它6株IBV分離毒株感染致死雞腎臟組織中同樣上調(diào)表達，證實不同IBV毒株的感染普遍誘導chIFITM1上調(diào)表達;鑒于自然狀態(tài)下氣管和腎臟中幾乎檢測不到chIFITM1的表達，因此chIFITM1在IBV靶器官氣管和腎臟中屬于病毒誘導型表達。同為禽呼吸道病毒的NDV感染24h就能在氣管中誘導ch

7、IFITM1上調(diào)表達，說明chIFITM1較早地參與了機體抗病毒反應。NDV感染致死雞的腎臟、氣管和腺胃中chIFITM1同樣顯著上調(diào)表達，說明IBV和NDV在體內(nèi)誘導chIFITM1表達方面具有相似性。體外過表達chIFITM1發(fā)現(xiàn)該蛋白顯著抑制NDV的復制。為了進一步鑒定chIFITM1發(fā)揮抗病毒作用的區(qū)域，我們通過生物信息學方法預測chIFITM1具有N端和C兩個膜外區(qū)，分別缺失N端35個氨基酸和C端7個氨基酸，發(fā)現(xiàn)chIFITM

8、1 C端雖僅有7個氨基酸，但C端的缺失使得chIFITM1極大地喪失了抑制NDV復制的能力。我們通過激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)與人源IFITM1不同，chIFITM1蛋白并沒有定位于細胞外膜而是位于細胞漿中，但并沒有與內(nèi)體標志物LAMP1共定位。以往的觀點認為IFITM蛋白通過定位在細胞膜或內(nèi)體膜上阻止病毒侵入從而發(fā)揮抗病毒作用，鑒于chIFITM1的獨特定位情況，我們推測chIFITM1可能與已報到的人源和鼠源IFITM蛋白不同，具有獨特的抗