Linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶的構建及其抗病毒活性的研究.pdf

1、HBV感染是當今最嚴重的健康問題之一,常會引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌.為了更好的觀察和證實我們構建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶在體內的作用,該實驗換用重組腺病毒載體RAd為后續(xù)的體內試驗及功能研究打下基礎.首先構建帶目的片段的腺病毒穿梭質粒,將各目的片段TR-L、TR、TRmut、HBVc、hEDN,克隆入腺病毒穿梭質粒pDC316.在293細胞中包裝形成含目的片段重組腺病毒、鑒定、擴增及滴度測定.獲得的各病毒滴度分別為(10<'7>pf

2、u/m1):RAd/TR-L:4.1;RAd/TR:4.5:RAd/TRmut:3.7;RAd/hEDN:5.6;RAd/HBVc:6.3;RAd/空:5.7.用獲得的重組腺病毒感染2.2.15細胞后,IFA顯示,感染RAd/TR-L的2.2.15細胞出現(xiàn)較強綠色熒光,說明RAd/TR-L在2.2.15細胞內有表達.以重組腺病毒分別感染2.2.15細胞,同時設立空感染為全陰性對照,48小時后提取細胞上清,應用RIA測定HBsAg、HBe

3、Ag含量顯示,RAd/TR-L及RAd/TR細胞上清中HBsAg、HBeAg的濃度與其它對照組相比有明顯下降(P<0.01),各對照組濃度差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05);TR-L組與TR組相比有差異(P<0.05).TR-L組與空感染組相比,上清中HBsAg、HBeAg的濃度分別下降了65.3％、62.7%.熒光定量PCR法測定上清HBV-DNA含量:TR-L組與TR組細胞上清中HBV-DNA的含量與對照組相比有明顯下降(P<0.0

4、1),各對照組含量差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05);TR-L組與TR組相比有差異(P<0.05).TR-L組與空感染組相比,濃度下降了59.9%.各組細胞感染后觀察形態(tài)與感染前無差別,MTT比色分析顯示,各組間差別無統(tǒng)計學意義,說明細胞增殖未受抑制.以上結果表明,linker的插入可能通過優(yōu)化HBVc和hEDN分子之間的空間構象降低其空間位阻而增強TR的抗HBV效率.盡管諸多實驗條件如細胞狀態(tài)、細胞數量、細胞代數等不同,但從TR-L真