慢性間歇性低壓低氧對發(fā)育大鼠心臟鈣穩(wěn)態(tài)的作用及其細胞與分子機制.pdf

1、大量研究表明,慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobarichypoxia,CIHH)對成年動物具有明顯的心臟保護作用,可有效對抗急性缺血/再灌注或急性缺氧/復氧對心肌的損傷、減少心肌梗死面積、限制心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷,以及抗心律失常。其機制可能涉及心肌抗氧化能力增強、心肌毛細血管密度及冠脈血流量增加、熱休克蛋白表達增加、NO產(chǎn)生增加、抗心肌細胞凋亡、穩(wěn)定線粒體及鈣處理功能、延長心肌動作電位時程及有效不應(yīng)

2、期等。有研究報道,CIHH對成年大鼠的心臟缺血/再灌注損傷作用與抗鈣超載、保持鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)。但有關(guān)CIHH對幼年動物發(fā)育心臟鈣穩(wěn)態(tài)的作用尚未明了。本研究旨在應(yīng)用功能學、細胞學、分子生物學及電生理學方法探討CIHH對幼年發(fā)育大鼠鈣穩(wěn)態(tài)的作用及其細胞和分子機制。
　　 本研究分為四部分:(1)應(yīng)用Langendor罐流技術(shù)觀察CIHH對發(fā)育大鼠心臟功能學及梗死面積的保護作用;(2)應(yīng)用激光共聚焦顯微熒光技術(shù),觀察CIHH對發(fā)育大鼠的心

3、室肌細胞內(nèi)游離鈣濃度的影響;(3)應(yīng)用分子生物學技術(shù)觀察CIHH對鈣處理蛋白表達的影響;(4)應(yīng)用全細胞膜片鉗方法觀察CIHH對發(fā)育大鼠心室肌細胞鈣離子通道電流和鈉鈣交換電流的影響,探討CIHH對鈣穩(wěn)態(tài)作用的離子機制。
　　 Ⅰ慢性間歇性低壓低氧對發(fā)育大鼠心臟的保護作用
　　 目的:應(yīng)用Langendorff灌流系統(tǒng)觀察CIHH對發(fā)育大鼠缺血/再灌注損傷的心臟功能學及梗死面積的影響。
　　 方法:雄性新生SD大鼠

4、按年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組(CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對照組(CON28)、42天對照組(CON42)。間歇性低氧處理動物置于低壓氧艙,分別接受28天、42天和56天模擬高原3000米(PB=525 mmHg,Po2=108.8 mmHg,5小時/天)的減壓低氧處理。應(yīng)用langendorff離體心臟灌流技術(shù)描記大鼠離體心臟左室功能,給予30分鐘全心缺血和60分鐘復灌處理。分別

5、記錄大鼠心臟缺血前及復灌后不同時間的左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVEDP)、最大壓力變化速率(±LV dp/dt)等心功能參數(shù)和冠脈流量(CF)。實驗結(jié)束后,測定測定其梗死面積。
　　 結(jié)果:
　　 1基礎(chǔ)狀態(tài)下,CIHH大鼠冠脈流量較對照大鼠明顯增多,其余心功能參數(shù)及梗死面積與對照大鼠無差異。缺血再灌注導致動物心功能受損、心肌梗死面積增大,但CON與CIHH動物間具有明顯差異。CIHH大鼠缺血/再灌注后心臟

6、功能的恢復明顯好于對照動物,表現(xiàn)為左心室發(fā)展壓(LVDP)和左心室最大壓力變化速率(±LVdp/dtmax)恢復增加(P＜0.05),左心室舒張末壓(LVEDP)恢復降低(P＜0.05),梗死面積減小(P＜0.05)。CIHH42大鼠抗心臟缺血再灌注損傷作用強于CIHH28大鼠。
　　 2 L型鈣通道開放劑,Bay K8644(0.5μM)和肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放開放劑,ryanodine(10 nM)可取消CIHH的心臟保護作用(P＜

7、0.05)。
　　 小結(jié):CIHH可增強發(fā)育大鼠抗心肌缺血/再灌注損傷的能力,具有明顯的心臟保護作用。其保護作用與心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)的維持有關(guān),增加外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放均可取消其保護作用。
　　 Ⅱ慢性間歇性低壓低氧對發(fā)育大鼠心室肌細胞內(nèi)游離鈣的影響
　　 目的:觀察CIHH對發(fā)育大鼠心室肌細胞內(nèi)游離鈣的影響并探討其可能機制。
　　 方法:雄性新生SD大鼠,根據(jù)年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組(

8、CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對照組(CON28)、42天對照組(CON42)。CIHH動物置于低壓氧艙,分別接受28天和42天模擬高原3000米(PB=525 mmHg,Po2=108.8mmHg,5小時/天)的減壓低氧處理。通過酶解法得到單個心室肌細胞,并用Fluo3-AM于37℃負載1小時。在缺血前、模擬缺血以及復灌過程中用激光共聚焦顯微鏡掃描記錄熒光強度及圖像。
　　 結(jié)果:
　　

9、 1正常臺氏液中,CON和CIHH組心室肌細胞內(nèi)游離鈣無顯著差異(P＞0.05),在5min模擬缺血和10min再灌注后,CON組心室肌細胞內(nèi)游離鈣濃度增加,而在CIHH28和CIHH42組減弱心室肌細胞內(nèi)游離鈣濃度增加幅度減少,與相應(yīng)CON有顯著差異(P＜0.05)。
　　 2 CIHH28和CIHH42的這一效應(yīng)可被L型鈣通道開放劑Bay K8644。肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑thapsigargin和PKC抑制劑chelerythr

10、ine chloride取消。
　　 小結(jié):CIHH可抑制發(fā)育大鼠心室肌細胞內(nèi)游離鈣濃度的增加,這一效應(yīng)可被Bay K8644,thapsigargin和chelerythrine chloride取消,提示CIHH的心臟保護效應(yīng)可能與抗鈣超載和PKC激活有關(guān)。
　　 Ⅲ慢性間歇性低壓低氧對發(fā)育大鼠鈣處理蛋白表達的影響
　　 目的:用Western blot方法研究CIHH對發(fā)育大鼠鈣處理蛋白表達的影響。

11、　　 方法:雄性新生SD大鼠,按年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組(CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對照組(CON28)、42天對照組(CON42)。CIHH動物置于低壓氧艙,分別接受28天和42天模擬高原3000米(PB=525mmHg,Po2=108.8 mmHg,5小時/天)的減壓低氧處理。組織勻漿后提取肌漿網(wǎng)和肌膜蛋白。用Westernblot方法檢測I/R時鈉鈣交換體(NCX1),

12、Ryanodine受體(RyR2)和肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2)蛋白的表達。
　　 結(jié)果:基礎(chǔ)狀態(tài)下,各組大鼠心肌NCX1,RyR2和SERCA2蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。在模擬缺血條件下,CON28和CON42大鼠心肌NCX1,RyR2和SERCA2蛋白表達明顯減少(P＜0.05),而CIHH28和CIHH42大鼠心肌的NCX1,RyR2和SERCA2蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)。
　　 小結(jié):CIHH可

13、對抗缺血/再灌注對發(fā)育大鼠心肌NCX1、RyR2和SERCA2蛋白表達的抑制,而發(fā)揮抗缺血/再灌注鈣超載作用。
　　 Ⅳ慢性間歇性低壓低氧對發(fā)育大鼠L型鈣電流及鈉鈣交換電流的影響
　　 目的:用全細胞膜片鉗技術(shù)研究CIHH對發(fā)育大鼠L型鈣電流(ICaL)及鈉鈣交換電流(Ina/Ca)的影響,探討CIHH心臟保護及抗鈣超載的離子機制。
　　 方法:雄性新生SD大鼠,按年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組

14、(CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對照組(CON28)、42天對照組(CON42)。CIHH動物置于低壓氧艙,分別接受28天和42天模擬高原3000米(PB=525 mmHg,Po2=108.8 mmHg,5小時/天)的減壓低氧處理。通過酶解法得到單個心肌細胞,利用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄及ICaL及Ina/Ca,觀察CIHH對大鼠心肌細胞ICaL和Ina/Ca的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1

15、ICaL
　　 1.1在正常細胞外液中,對照組和間歇性低氧組的ICaL峰值電流和I-V曲線無顯著差異(P＞0.05)。模擬缺血和再灌注時,CON28和CON42組心肌細胞的ICaL峰值電流明顯減少(P＜0.05),I-V曲線向上移位,而CIHH28和CIHH42組心肌細胞峰值ICaL電流和I-V曲線無明顯變化(P＞0.05)。
　　 1.2各組心肌細ICaL的穩(wěn)態(tài)激活、失活后復活曲線在正常細胞外液、模擬缺血和再灌注條件下

16、均無明顯變化(P＞0.05)。在正常細胞外液中,各組心肌細胞ICaL的穩(wěn)態(tài)失活曲線無明顯變化(P＞0.05)。模擬缺血和再灌注時,CON組心肌細胞ICaL的穩(wěn)態(tài)失活曲線向左移位(P＜0.05),而CIHH組心肌細肌ICaL的穩(wěn)態(tài)失活曲線無顯著變化(P＞0.05)。
　　 2 Ina/Ca
　　 2.1正常細胞外液中,各組心肌細胞的Ina/Ca無顯著差異(P＞0.05)。在模擬缺血條件下,CON28和CON42組心肌細胞L

17、na/Ca,的內(nèi)向電流和外向電流部分均減少(P＜0.05),內(nèi)向電流的抑制比外向電流更明顯。而CIHH28和CIHH42組心肌細胞Ina/Ca無顯著變化(P＞0.05)。
　　 2.2模擬缺血條件下,CON28和CON42組心室肌細胞Ina/Ca反轉(zhuǎn)電位向負值方向移位(P＜0.05),而CIHH28和CIHH42組心室肌細胞Ina/Ca反轉(zhuǎn)電位無顯著變化(P＞0.05)。
　　 小結(jié):CIHH對基礎(chǔ)狀態(tài)的發(fā)育大鼠心室肌細