12732.高產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

1、高產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的構(gòu)建高產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的構(gòu)建ConstructionofriboflavinoverproducedBacillussubtilis專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)研究生：石楊指導(dǎo)教師：王勁峰教授指導(dǎo)教師：張大偉研究員天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院二零一四年五月摘要枯草芽孢桿菌能否過(guò)量合成核黃素的關(guān)鍵是核黃素操縱子（rib操縱子）的表達(dá)量，野生型枯草芽孢桿菌中rib操縱子表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，而無(wú)法過(guò)量積累核黃素。為了讓菌株過(guò)

2、量合成核黃素，需解除rib操縱子受到的調(diào)控。通過(guò)雙交換同源重組的方式進(jìn)行改造，把rib操縱子的啟動(dòng)子的35區(qū)第一個(gè)堿基發(fā)生了T突變成C，可以增加啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度；同時(shí)用強(qiáng)RBS序列替換了rib操縱子中參與調(diào)控的前導(dǎo)區(qū)，解除了調(diào)控的同時(shí)增加了操縱子轉(zhuǎn)錄出的mRNA的穩(wěn)定性，使核黃素操縱子轉(zhuǎn)錄水平提高了1602倍。ypaA編碼核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)核黃素吸收，敲除它目的是減少核黃素的吸收。ywlF編碼核糖5磷酸異構(gòu)酶，催化核酮糖5磷酸異構(gòu)生成

3、核糖5磷酸。過(guò)表達(dá)ywlF是為了，增加核糖5磷酸的濃度?；騳wlF替換基因ypaA后，核黃素產(chǎn)量從158.1mgL下降到61.4mgL，下降了61.2%?？赡苁腔騳paA編碼的核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是雙向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，不只參與核黃素的吸收，還參與外排。在枯草芽孢桿菌中電子傳遞鏈有兩條，一個(gè)是通過(guò)aa3氧化酶，另一條是通過(guò)bd氧化酶，但是aa3氧化酶的產(chǎn)能效率更高。敲除編碼bd氧化酶的cyd基因后，電子傳遞鏈只能通過(guò)aa3氧化酶?jìng)鬟f，提高了菌體的

4、能量利用效率，降低了菌體的維持能，核黃素產(chǎn)量達(dá)到194.3mgL。prs基因編碼核糖磷酸焦磷酸（PRPP）激酶，是核黃素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。把prs整合到xylR位點(diǎn)，從而增加核糖磷酸焦磷酸激酶表達(dá)量，增加PRPP的濃度。PRPP的濃度的增加可以降低AMP對(duì)purF的阻遏作用，也可以和PurR結(jié)合解除其對(duì)嘌呤從頭合成途徑的阻遏作用。改造后核黃素產(chǎn)量為212.5mgL，和cyd敲除菌相比提高9.3%。rbsK基因編碼核糖激酶，在戊糖磷