小黑楊花粉植株轉抗蟲基因的研究.pdf

1、在建立了小黑楊花粉植株再生優(yōu)化組培體系:分化培養(yǎng)基為MH+BA0.1 mg/L+NAA0.05mg/L,生根培養(yǎng)基為MH+IBA0.4mg/L的基礎上進行遺傳轉化.確定農桿菌介導的小黑楊遺傳轉化體系:在上述分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的基礎上進行遺傳轉化;葉片預培養(yǎng)2~3d后,進行侵染;工程菌液OD600=0.3~0.5,浸泡時間為5min,25℃,置暗處共培養(yǎng)2~4d;轉入含卡那霉素濃度為40mg/L的選擇培養(yǎng)基上,進行選擇培養(yǎng),同時用濃度

2、700mg/L的頭孢唑林鈉對葉片進行脫菌;得到卡那霉素抗性芽后,在生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)(含有40mg/L卡那霉素,700mg/L頭孢唑林鈉).在建立小黑楊花粉植株遺傳轉化體系基礎上,利用農桿菌介導法向小黑楊植株基因組中導入抗蟲基因(蜘蛛殺蟲肽與Bt基因C末端肽序列連接在一起表達的一種融合蛋白基因),獲得3個轉化無性系,轉化率為0.62﹪,GUS表達陽性率為75﹪,并對其進行分子生物學檢測和飼蟲試驗.卡那霉素抗性植株的分子生物學檢測表

3、明,PCR檢測陽性率均為100﹪,Southern斑點雜交陽性率34﹪,轉基因植株目的基因的PCR-Southern雜交陽性率為1 00﹪.說明外源基因已穩(wěn)定整合到小黑楊花粉基因組中.轉基因小黑楊的蟲飼試驗表明,接舞毒蛾2齡幼蟲,殺蟲率達62.5﹪~92.5﹪,陰性對照植株蟲飼死亡率5﹪~13.3﹪,陽性植株飼喂舞毒蛾死亡率高于陰性對照植株飼喂舞毒蛾死亡率,而且集中在飼蟲初期,說明基因表達產物水平較高.咬食轉基因植株的尚存活舞毒蛾平均蟲