豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的高效可溶性表達和檢測血清抗體的間接ELISA方法的建立.pdf

1、揚州大學博士學位論文豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的高效可溶性表達和檢測血清抗體的間接ELISA方法的建立姓名：陳義平申請學位級別：博士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：劉秀梵20030501揚州大學博士學位論文核表達，其中部分報道還對核衣殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達方式進行了分析，結果均是以包涵體形式存在。本試驗將美洲型P R R S V V R2 3 3 2 株核衣殼蛋白基因克隆到表達載體p G E X 一6 P 一1 中谷胱甘肽一s

2、 一轉移酶( G S T ) 基因的下游，重組質粒轉化大腸桿菌B L 2 1 ，通過對各種表達條件進行優(yōu)化，實現(xiàn)了P R R S V 核衣殼蛋白基因在原核表達系統(tǒng)中的可溶性表達。經S D S —P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析，G S T —N 融合蛋白的分子量約為3 9 ．5 k D a ，另外，還有三種不同大小的G S T —N 降解產物，分子量分別為3 3k D a ，3 0 ．5k D a 和2

3、7 ．5k D a ，3 9 ．5k D a 的G S T —N 及其3 0 ．5k D a 的降解產物分別占菌體蛋白的3 0 ．9 ％和1 5 ．3 ％，總表達量約占菌體蛋白的一半。重組菌經超聲波裂解后，用G l u t a t h i o n e S e p h a r o s e4 B 親和層析純化表達產物，每毫升床體積的G S T - N 融合蛋白收獲量達1 5 m g ，回收的G S T - N 融合蛋白濃度達到8 m g ／

4、m 1 。用P r e S c i s s i o nP r o t e a s e 切去G S T —N 融合蛋白中的G S T 成分，得到純化的重組核衣殼蛋白。經間接E L I S A 證實，大腸桿菌中表達的G S T —N 融合蛋白以及切去G S T 純化的N 蛋白均可作為診斷抗原，用于P R R S V 抗體的檢測。用G S T - N 融合蛋白以及切去G S T 后純化的N 蛋白免疫B A L B ／c 小鼠制備的抗血清均能與

5、S f 9 細胞內表達的重組核衣殼蛋白發(fā)生特異性反應，可見P R R S V 核衣殼蛋白的原核表達產物也具有良好的免疫原性。三、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體間接E L I S A 檢測方法的建立及其應用分別用昆蟲細胞內表達的重組核衣殼蛋白( B a c - N ) 、大腸桿菌內表達的G S T —N融合蛋白、以及切去G S T 后純化的N 蛋白作為診斷抗原，同時設立必要的陰性抗原對照，結果可見B a c - N 、G S T - N 以及

6、N 蛋白均能特異性地識別P R R S V 抗體陽性血清樣品和陰性血清樣品，而且根據(jù)針對陰性抗原以及陰性抗體反應的o D 值可見，三種檢鋇4 用抗原都具有較高的敏感性。因此，B a c - N 、G S T —N 、N 蛋白均可作為診斷抗原，用于P R R S V 抗體檢測。但考慮到B a c —N 為昆蟲細胞裂解后的粗提制劑，含有較多的細胞蛋白成分，需設立正常S f 9 細胞裂解上清作為陰性抗原對照，同一份血清樣品要對陽性抗原和陰性抗

7、原同時進行平行檢測，而上述N 蛋白純化抗原的制各需要蛋白酶P r e S c i s s i o nP r o t e a s e 的切割，從而大大增加了抗原制備的經費開支，因此選用親和層析純化的G S T —N 作為檢鍘抗原。以方陣滴定法確定G S T —N 最佳包被濃度為每孔4 0 0 n g ，待檢血清最佳稀釋度為1 ：i 0 0 。血清樣品的0 D ?！軴 ．4 3 X O D ，．+ O ．5 7 ×o D k 判為