沙田柚花粉壁蛋白和酸柚花粉壁蛋白的比較.pdf

1、采摘沙田柚(Citrus grandis Var. Shatinyu Hort)以及野生酸柚(Citrus grandis L.)盛花期的雄花,將兩者的花粉放入冷的pH6.7、1%Nacl緩沖液{10%蔗糖、0.45mM Ca2+(Cacl2 ·6H2O)、1.63 mM B(H3BO3)},在 5min,10min,20min,30min,40min,50min,60min,3h等不同時間內抽濾、提取其壁蛋白后直接透析除鹽,然后在紫外

2、分光光度計280nm下測定OD值。由于免去了研磨、緩沖液靜置提取、冷凍離心等步驟,因此大大縮短了材料的處理時間。不同時間取樣測定結果表明：(1)兩者花粉壁釋放的蛋白質在40min內隨提取時間的增加而增加,40min后不再繼續(xù)釋放,并保持一定的釋放量：沙田柚自40min后,花粉壁蛋白的釋放量一直保持在0.364 mg/ml的水平上；而酸柚自40min后,壁蛋白的釋放量一直保持在0.488 mg/ml的水平上。(2)5min提取的濾液中蛋白

3、含量已達全部釋放蛋白質的一半以上,這同Lewis在月見草中的結果是一致的。(3)進一步的分析發(fā)現(xiàn),酸柚花粉壁蛋白質的釋放,無論在速度上,還是在量上,都比沙田柚的大。以酸柚花粉壁不同時間提取物為對照組,采用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、等電聚焦(IEF-PAGE)、雙向電泳(IEF/SDS-PAGE)等電泳技術對沙田柚和酸柚花粉壁不同時間蛋白提取物進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)：(1)兩者不

4、同時間花粉壁滲出液經非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離,考馬斯亮藍 R-250 染液染色,都可明顯分出7個區(qū)帶,并且,在Ⅴ區(qū),兩者共同出現(xiàn)譜帶A。所不同的是沙田柚5min蛋白提取液圖譜中已經含有絕大部分蛋白譜帶,隨后,各時間提取液圖譜中的蛋白譜帶在此基礎上于各區(qū)中或增或減；而酸柚直到提取時間為40min時,其圖譜中才基本上包含有絕大部分的蛋白譜帶,隨后的50min、60min、3h譜帶的分布就是在此基礎上有增有減,并且這種增減情

5、況主要發(fā)生在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ區(qū)間、Ⅶ區(qū)。(2)兩者花粉壁蛋白經變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后都出現(xiàn)多條染色帶,經與在同樣條件下電泳的標準蛋白比較,并輔助 SPSS數理統(tǒng)計軟件對兩者的SDS-PAGE圖譜分布情況進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)沙田柚不同時間提取液中所含的主要蛋白質的分子量主要是分布于1、3、4、5等四個區(qū)間內。而酸柚花粉壁則主要含有分子量位于2、4、5等三個區(qū)間內的蛋白質。(3)兩者的等電點測定結果表明,在pH8.0區(qū)域內

6、、pH6.5~5.8、pH5.8~5.4、pH5.4~4.4之間,沙田柚與酸柚不同時間花粉壁蛋白提取液的IEF圖譜都具有共同的譜帶。所不同的是隨著提取時間的增加,沙田柚花粉壁的堿性蛋白增加,而<；WP=3>；酸柚既有堿性蛋白的增加,又有酸性蛋白的增加。(4)經銀染法染色后的沙田柚和酸柚花粉壁蛋白圖譜,分辨率較高,可分辨出近100個蛋白質斑點。兩者的蛋白質格局完全不一樣,就pH值分布區(qū)域而言,沙田柚花粉壁的蛋白質斑點主要分布于pH

7、7.2-5.8之間,而酸柚的花粉壁蛋白質斑點密集于pH8.0-6.5；pH5.4-3.95兩個區(qū)域范圍之間；就分子質量分布區(qū)域而言,沙田柚花粉壁的蛋白質斑點主要密集于14.4Ku~43.0Ku,而酸柚在20.1Ku~43.0Ku和31.0Ku~97.4Ku兩個區(qū)域內分布有較多的蛋白質斑點。值得注意的是：沙田柚花粉壁蛋白在pH7.2~5.8范圍內存在有很多小分子量的蛋白質,如a、b、c、d、e點,其中有一點e落入花柱S-糖蛋白范圍內(pH

8、6.2~9.5,MW 24KD~32KD),根據對S-核酸酶在不親和反應中作用機制的兩種假說,它們很有可能與花粉S基因產物有關。這些電泳結果表明：(1)相似性可能反映花粉中可溶性蛋白的共同性；(2)明顯差異性反映了植物品種和基因的差異,可作為遺傳分析的一種附屬手段。此外,根據實驗結果,討論了沙田柚和酸柚花粉壁蛋白的比較及其意義,同時也探討了花粉自交不親和性調控的可能的作用機制。以期為解釋沙田柚配子體自交不親和——花粉S基因產物作用機制提