禽白血病p27基因的原核表達和兔抗p27抗體的制備.pdf

1、該研究根據(jù)已發(fā)表的AMV BAI-A株的基因序列設計了一對特異性引物,以重組質(zhì)粒pGEM-gag為模板,采用PCR法對p27基因進行亞克隆,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-p27.對重組質(zhì)粒PGEM-p27和表達載體pET-28α進行雙酶切,回收酶切產(chǎn)物,連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒.將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,篩選含重組質(zhì)粒的基因工程菌.重組工程菌經(jīng)IPTG誘導得到高效表達,其細胞裂解物用SDS—PAGE及Western

2、 blotting進行檢測.用Ni-NTA親和層析法純化表達蛋白,經(jīng)SDS—PAGE方法及Western blotting檢測,分析純化的蛋白.用p27蛋白按照常規(guī)的方法免疫健康家兔,5周后收集兔血清,用瓊脂擴散法和ELISA法測定抗血清的效價,用Western blotting檢測其特異性.結(jié)果表明,該研究成功地亞克隆了禽白血病p27基因.所構(gòu)建的表達質(zhì)粒pET28α-p27在BL21(DE3)中成功表達了分子量約為30KDa的融合蛋

3、白,與預測的大小一致.薄層掃描的結(jié)果顯示p27蛋白的表達量約占菌體總蛋白的25.3％.Western blotting檢測顯示表達的重組蛋白是特異性的.經(jīng)Ni-NTA樹脂純化得到的產(chǎn)物純度達97％.用瓊擴試驗檢測抗血清的效價能達到1:32.用抗血清作為一抗進行Western blotting檢測,結(jié)果表明此抗血清是針對p27的多抗.用抗血清作為包被抗體,用AMV血毒作為檢測抗原,進行ELISA試驗,結(jié)果表明當抗血清稀釋到4000倍時,其