中國(guó)荷斯坦種公牛FAK基因調(diào)控區(qū)的遺傳變異鑒定及其與精液品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、在現(xiàn)代奶牛群體改良中，種公牛是影響奶牛群體遺傳品質(zhì)的主要因素，其對(duì)奶牛群體遺傳進(jìn)展的貢獻(xiàn)率高達(dá)70％以上。精液品質(zhì)性狀是種公牛選育工作中最基本的一項(xiàng)衡量指標(biāo)，受到多基因控制，而常規(guī)育種手段選育良種公牛效率低，因此結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，篩選出影響種公牛精液品質(zhì)的候選基因作為分子標(biāo)記，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇育種，為未來(lái)定向選育高品質(zhì)精液的種公牛提供參考。
　　粘著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一類(lèi)胞質(zhì)非受體

2、蛋白酪氨酸激酶（PTKs），它在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，它是胞內(nèi)外信號(hào)出入的中樞，介導(dǎo)多條信號(hào)通路。FAK還參與精子的釋放和精子的獲能等過(guò)程，在機(jī)體睪丸中具有較高的表達(dá)量，據(jù)此推測(cè)FAK基因可能是影響種公牛精液品質(zhì)的一個(gè)候選基因。因此本課題以218頭中國(guó)荷斯坦種公牛精液為樣本，通過(guò)PCR和DNA測(cè)序技術(shù)篩選FAK基因的5'側(cè)翼區(qū)和3'UTR區(qū)中的突變位點(diǎn)，運(yùn)用SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析這些突變位點(diǎn)與公牛精液品質(zhì)的關(guān)系，通過(guò)實(shí)驗(yàn)最終鑒定出功能

3、性的突變位點(diǎn)。
　　1、中國(guó)荷斯坦公牛FAK基因3'UTR SNP的鑒定及其與精液品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)FAK基因的3'UTR區(qū)進(jìn)行了SNPs位點(diǎn)的掃描，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SNP，即g.129462_129463insGAA。對(duì)該 g.129462_129463insgaa SNP位點(diǎn)與種公牛精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，野生基因型BB種公牛個(gè)體的射精量和鮮精密度顯著高于AA基因型種公牛。
　　2、3

4、'UTR SNP g.129462_129463insGAA對(duì)bta-miR-21調(diào)控FAK基因表達(dá)的影響
　　利用miRNA在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)與FAK基因3'UTR區(qū)域結(jié)合的miRNAs。結(jié)果表明FAK基因3'UTR上的突變位點(diǎn)g.129462_129463insGAA位于bta-miR-21的種子序列區(qū)，而且發(fā)現(xiàn)此SNP突變前后影響FAK基因和bta-miR-21的結(jié)合能力。為了更好的驗(yàn)證分子標(biāo)記g.129462_129463ins

5、GAA對(duì)bta-miR-21與FAK基因3'UTR片段結(jié)合能力的影響，利用細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)對(duì)上述預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。分別將含有突變型和野生型兩種基因型的FAK基因3'UTR片段連入 pMIR-ReportTM Luciferase報(bào)告載體中，與bta-miR-21真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與 pMIR-REPORT Luciferase-FAK野生型重組質(zhì)粒相比，bta-miR-21質(zhì)粒與 pMI

6、R-REPORT Luciferase-FAK突變后的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可使細(xì)胞的熒光素酶活性下降。通過(guò)Q-PCR檢測(cè)g.129462_129463insGAA位點(diǎn)不同基因型個(gè)體中FAK mRNA的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BB基因型個(gè)體中FAK mRNA的含量極顯著（P<0.01）高于AB基因型。上述的關(guān)聯(lián)分析也表明，BB基因型個(gè)體的射精量和鮮精密度顯著高于AA型種公牛，因此我們推測(cè)此SNP可能通過(guò)影響bta-miR-21與FAK基因3'UTR的結(jié)

7、合能力，影響FAK基因的表達(dá)量，從而影響精子的釋放。
　　3、中國(guó)荷斯坦公牛FAK基因的啟動(dòng)子區(qū)SNP與精液品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析
　　啟動(dòng)子作為基因必不可少的元件，可以影響基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和表達(dá)的強(qiáng)度。本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)FAK基因的啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)一些序列可與各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，包括NFATC1，STAT1，STAT3，F(xiàn)OXP1，SOX18，SP1等，這些位點(diǎn)的存在可能涉及FAK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該預(yù)