棉花果膠甲酯酶基因GhPME6的克隆及初步功能分析.pdf

1、棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，是紡織工業(yè)天然纖維的主要來(lái)源。棉纖維發(fā)育過(guò)程可分為纖維細(xì)胞起始、伸長(zhǎng)、次生壁增厚和脫水成熟四個(gè)時(shí)期。其中，次生壁加厚與棉纖維比強(qiáng)度形成有著重要關(guān)系。然而，當(dāng)前大部分研究主要集中在棉纖維的起始和伸長(zhǎng)階段，纖維次生壁加厚階段的研究還很不深入。因此，針對(duì)棉纖維次生壁加厚期的遺傳機(jī)理開(kāi)展深入研究，克隆控制棉纖維比強(qiáng)度性狀形成的關(guān)鍵功能基因，不僅對(duì)揭示棉纖維比強(qiáng)度形成的分子機(jī)理具有重要意義，而且在纖維比強(qiáng)度遺傳改良方面

2、也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　果膠甲酯酶(Pectin Methylesterase，PME)是植物中普遍存在的一類(lèi)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化相關(guān)的酶，可催化細(xì)胞壁中的果膠水解產(chǎn)生果膠酸和甲醇，形成了大量的游離羧基端。游離的羧基端與細(xì)胞壁中的Ca2+結(jié)合形成凝膠，從而提高細(xì)胞壁的硬度及堅(jiān)固性。本研究以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1為研究材料，利用基因克隆、進(jìn)化分析、實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析、原核蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)基因擬南芥功能驗(yàn)證等方法，初步揭示了GhPME

3、6基因在棉纖維發(fā)育過(guò)程中的作用。本研究結(jié)果如下:
　　1、本研究結(jié)合棉花基因組數(shù)據(jù)和本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的纖維次生壁加厚期cDNA消減文庫(kù)，獲得一條在棉纖維次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的EST序列。生物信息學(xué)分析表明，該EST序列編碼部分果膠甲酯酶蛋白序列。
　　2、從陸地棉TM-1中成功克隆到該EST序列的全長(zhǎng)基因，命名為GhPME6。
　　3、通過(guò)對(duì)不同棉屬基因組中的PME6基因進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)PME6基因在棉屬基因組的進(jìn)化過(guò)程

4、中具有高度保守性。
　　4、qRT-PCR分析顯示，GhPME6在纖維發(fā)育次生壁加厚期大量表達(dá)。
　　5、構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-GhP ME6，在大腸桿菌BL21菌株中完成GhPME6蛋白的原核表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明，原核表達(dá)的蛋白分子量約為57KDa，與目的蛋白預(yù)期大小相符，并通過(guò)Western blotting進(jìn)一步驗(yàn)證了原核表達(dá)的GhPME6蛋白。
　　6、構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-GhP