杉木microRNA399a的功能研究.pdf

1、microRNAs(簡稱miRNA)是一類長約20～24個堿基的內(nèi)源性單鏈RNA，它廣泛的存在于原核、病毒和真核生物中。miRNA通過對靶基因mRNA的互補配對介導(dǎo)靶mRNA的降解或抑制蛋白水平的翻譯，從而對靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)調(diào)控。近些年的研究表明，miRNA對植物的生長發(fā)育和某些器官形成的各個階段都具有重要調(diào)控作用。目前研究發(fā)現(xiàn)miR399存在于擬南芥、水稻和小麥等多種植物中，是植物中一類保守的miRNA。但是，目前對Cln-

2、miR399a的生物學(xué)功能以及其自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍知之甚少。本論文運用了生物信息學(xué)、分子細(xì)胞學(xué)、高通量測序和遺傳學(xué)等方法，以模式植物擬南芥為研究材料，構(gòu)建35S: Cln-miR399a前體的表達(dá)載體，獲得了Cln-miR399a過表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因純合株系，展開了Cln-miR399a在擬南芥的表達(dá)模式和調(diào)控機制的研究。通過分子細(xì)胞生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因株系表型的觀察得到以下結(jié)果:
　　(1)通過高通量測序和生物信息學(xué)的方法，從杉木基因組

3、DNA中鑒定并克隆了杉木Cln-miR399a的前體序列;根據(jù)Cln-miR399a高度保守的結(jié)合位點特征，在杉木基因組數(shù)據(jù)庫中預(yù)測和分析其潛在的靶基因，初步確定靶基因為Unigene56556，并且其成熟序列和擬南芥miR399c的成熟序列完全相同;
　　(2)構(gòu)建過表達(dá)35S: Cln-miR399a載體，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)杉木miR399a能夠在擬南芥中異源表達(dá);并且在開花期和果莢期，Cln-miR399a

4、在葉片的表達(dá)水平高于根部，而在根和葉中，果頰期Cln-miR399a的表達(dá)量較高，初步明確Cln-miR399a在擬南芥中存在時空表達(dá)特異性;
　　(3)實時熒光定量PCR(Real-time PCR)進(jìn)一步分析顯示，Cln-miR399a能夠使靶基因PHO2的表達(dá)量顯著下調(diào);通過5'RACE實驗，明確的驗證出了Cln-miR399a對同源靶基因Unigene56556的切割位點在第21和22位之間。煙草瞬時轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果進(jìn)一步顯示