LRR型受體蛋白激酶OsRPK1通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和極性運(yùn)輸調(diào)控高鹽脅迫下水稻的根系結(jié)構(gòu).pdf

1、鹽脅迫能夠影響植物的根系結(jié)構(gòu)，目前研究表明SOS信號(hào)途徑在低鹽脅迫促進(jìn)根系生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，而對(duì)于高鹽脅迫抑制根系結(jié)構(gòu)的機(jī)制仍不清楚。LRR型受體蛋白激酶是數(shù)目最龐大的激酶家族之一，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)外界環(huán)境變化等途徑。前期研究在水稻根尖組織中鑒定了新的鹽脅迫響應(yīng)LRR型受體蛋白激酶OsRPK1，本文旨在通過(guò)過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)OsRPK1轉(zhuǎn)基因水稻研究其參與高鹽脅迫調(diào)節(jié)根系結(jié)構(gòu)的機(jī)制。
　　對(duì)OsRPK1序列進(jìn)行生物信息學(xué)

2、分析表明OsRPK1基因有兩個(gè)異構(gòu)體，分別為L(zhǎng)OC_Os05g40770.1和LOC_Os05g40770.2，PCR擴(kuò)增只檢測(cè)到LOC_Os05g40770.1異構(gòu)體，而未檢測(cè)到LOC_Os05g40770.2，所以我們以LOC_Os05g40770.1為研究對(duì)象。該基因具有18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子，CDS區(qū)含有2910bp核苷酸，共編碼969個(gè)氨基酸。分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表明OsRPK1含有典型LRR型受體蛋白激酶的四個(gè)結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)分

3、析結(jié)果表明OsRPK1蛋白在其它植物基因組中沒(méi)有同源關(guān)系很近的同源蛋白，說(shuō)明OsRPK1蛋白是一個(gè)新型的LRR型受體蛋白激酶。結(jié)合半定量RT-PCR和Genevestigator數(shù)據(jù)庫(kù)微列陣數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)OsRPK1基因在生長(zhǎng)素含量較高的部位如根尖、葉片、莖間、胚芽鞘表達(dá)量最高;OsRPK1的表達(dá)主要受生長(zhǎng)素(2，4-D、IAA)和150mMNaCl、16％PEG6000誘導(dǎo)表達(dá)，而30mMNaCl和80mMNaCl對(duì)OsRPK1表達(dá)量沒(méi)

4、有明顯影響。這表明OsRPK1可能與生長(zhǎng)素和高鹽引起的滲透脅迫有關(guān)。
　　原核表達(dá)OsRPK1胞外LRR區(qū)獲得融合蛋白GST-OsRPK1-LRR，利用同位素H3標(biāo)記的IAA與未被同位素標(biāo)記的IAA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GST-OsRPK1-LRR和ITC法分析IAA與GST-OsRPK1-LRR相互作用實(shí)驗(yàn)都表明GST-OsRPK1-LRR與生長(zhǎng)素不結(jié)合。將OsRPK1基因正反向插入pGSA1285獲得正反義植物表達(dá)載體，分別通過(guò)農(nóng)桿菌EHA

5、105介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化野生型日本晴水稻愈傷，抗性篩選愈傷、分化成苗。NorthernBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻OsRPK1表達(dá)量，確定獲得OsRPK1過(guò)表達(dá)植株O1、O7和OsRPK1抑制表達(dá)植株A5、A7、A9。
　　正常生長(zhǎng)條件下，抑制表達(dá)OsRPK1可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)，例如側(cè)根和不定根增多、根尖分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)發(fā)達(dá)、葉片和葉鞘細(xì)胞膨脹、植株增高、分蘗數(shù)變多。相比之下，過(guò)表達(dá)OsRPK1轉(zhuǎn)基因水稻則表現(xiàn)出相反的表型。OsRPK1能夠

6、影響水稻愈傷大小，并且IAA處理后抑制表達(dá)植株質(zhì)膜H+-ATPase活性顯著上升，而過(guò)表達(dá)植株幾乎沒(méi)有變化。通過(guò)HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻不同部位的生長(zhǎng)素含量，結(jié)果表明OsRPK1抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻從根莖結(jié)合區(qū)到根尖的生長(zhǎng)素含量都比OsRPK1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻和野生型高。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(NPA)處理觀察其根部表型，發(fā)現(xiàn)OsRPK1抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑不敏感，不定根僅下降29％，側(cè)根下降35％。利用H3-IAA同

7、位素示蹤顯示OsRPK1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株莖部H3-IAA的含量明顯要比OsRPK1抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻少，同時(shí)添加NPA后發(fā)現(xiàn)H3-IAA的含量都相對(duì)減少。這些結(jié)果表明OsRPK1參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和極性運(yùn)輸。
　　正常生長(zhǎng)條件下，OsRPK1過(guò)表達(dá)植株的側(cè)根和不定根發(fā)生和生長(zhǎng)受到明顯的抑制，且在分子水平上抑制大部分生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)基因PINs、Aux/IAXs和誘導(dǎo)生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因Aux/IAAs的表達(dá)，這與高鹽脅迫下野生

8、型水稻表型和生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)基因PINs、Aux/IAXs表達(dá)模式相似。而OsRPK1抑制表達(dá)植株耐鹽性增強(qiáng)，側(cè)根、不定根與PINs、Aux/IAXs表達(dá)都未受明顯的影響。因此我們認(rèn)為，OsRPK1在正常生長(zhǎng)情況下保持低水平表達(dá)，高鹽脅迫能夠誘導(dǎo)其表達(dá)。高水平表達(dá)OsRPK1一方面抑制生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)基因PINs、Aux/IAXs表達(dá)，降低生長(zhǎng)素在根部的極性運(yùn)輸和含量;另一方面，高水平表達(dá)OsRPK1還可誘導(dǎo)Aux/IAAs表達(dá)，由于Aux/IAA