調(diào)控鴨胚胎早期發(fā)育及后期強弱關(guān)鍵基因的篩選與鑒定.pdf

1、孵化率是家禽的重要經(jīng)濟性狀之一。與雞的人工孵化率相比(81～85％)，種鴨受精蛋的孵化率較低(65～82％)，其影響因素主要包括種禽日齡、蛋的大小和蛋的污染程度等。目前，對禽類孵化率的研究多集中在遺傳背景、種蛋品質(zhì)和孵化條件等方面，其分子調(diào)控機制的研究甚少。禽類胚胎發(fā)育的早期和后期是影響孵化率的兩個關(guān)鍵時間點，因此本論文旨在通過對這兩個時期鴨胚發(fā)育差異表達基因或蛋白的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式進行研究，以期初步了解胚胎發(fā)育的分子機制，并為分子標記輔助

2、育種，提高胚胎孵化率提供理論基礎(chǔ)。
　　試驗一:分別采集鴨上一個蛋產(chǎn)出后6h（卵裂期）和25h（明區(qū)形成期）的胚盤作為驅(qū)動組和實驗組，采用DSN酶介導的均一化消減雜交方法(DSNH)，建立了鴨早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因的消減文庫，并對篩選獲得的關(guān)鍵基因進行實時熒光定量PCR(qPCR)驗證。結(jié)果隨機挑選216個陽性克隆進行測序，獲得了66條差異表達序列，通過BLASTX比對，39個基因可注釋到已知蛋白上。GeneOntology(GO)

3、功能分類結(jié)果表明，差異基因分別與代謝、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運、增殖/凋亡、細胞周期、細胞粘附和甲基化等生物過程或功能相關(guān)。此外，獲得了編碼302個氨基酸的Nanog基因cDNA序列全長，與其他物種相似，保守區(qū)為63氨基酸組成的同源結(jié)構(gòu)域，是Nanog蛋白發(fā)揮功能的核心區(qū)。對關(guān)鍵基因進行qPCR驗證，結(jié)果顯示，在上一個蛋產(chǎn)出6h的胚盤中未檢測到Nanog基因表達，20h有少量表達，25h較高表達(P＜0.05)。HSP90AA1在20h和25h胚盤中

4、的表達水平顯著升高(P＜0.05)。DEKmRNA在6h和20h胚盤中表達水平接近(P＞0.05)，而在25h表達極顯著升高（P＜0.05）。EIF2AK3、DNMT3B、RCP三個基因在25h的胚盤中表達顯著上調(diào)（P＜0.05），與建庫結(jié)果一致。
　　實驗二:應(yīng)用基于新一代高通量測序技術(shù)（RNA-seq）結(jié)合生物信息學方法，分析了兩組樣本在轉(zhuǎn)錄組水平所有基因表達的差異。結(jié)果表明，正常出殼和輔助出殼組分別獲得77，572，048和

5、79，921，784原始reads，去除冗余、低質(zhì)量的reads以及接頭序列后，分別得到73，975，798和77，977，436cleanreads，用Trinity軟件將其拼接，最終獲得盡可能長的拼接轉(zhuǎn)錄本(unigenes)。對兩組拼接數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，≥200bp的unigene分別有159，083和161，804個，平均長度為862bp和1206bp，N50的長度分別為1769和3059bp。兩組拼接的所有非冗余序列用BLASTX

6、軟件與NCBINr和Swiss-Uniprot數(shù)據(jù)庫進行比對與注釋，74,045unigenes可以匹配到20，840個已知蛋白上。選擇P＜0.005、FDR≤0.001且差異大于2倍的基因為顯著差異表達基因，結(jié)果獲得注釋的差異表達基因1629個，輔助與正常出殼組相比，510個基因表達上調(diào)，1119個基因表達下調(diào)。輔助出殼鴨肝臟中，與能量代謝相關(guān)的基因G6PC和ATP5A1表達上調(diào)，而參與免疫防御作用的關(guān)鍵基因GSTA1、GAL9、MH

7、CⅠ和MHCⅡ表達顯著下調(diào)，進一步的qPCR檢測顯示，ATP5A1、ATP7B、FEZ2、MHCⅠ和MHCⅡ5個基因的表達模式與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。此外，對轉(zhuǎn)錄組SSR標記分析表明，SSR標記重復(fù)類型以完全型為主，其中三核苷重復(fù)類型數(shù)目最多，其次是二核苷酸。不完全型中僅有二核和三核苷酸兩種重復(fù)類型。
　　實驗三:應(yīng)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定與生物信息學方法，初步分析了輔助與正常出殼鴨肝臟蛋白質(zhì)組的差異。結(jié)果鑒定出143個表達差異

8、蛋白，與正常出殼組相比，輔助出殼組有78個蛋白表達上調(diào)，65個蛋白表達下調(diào)。GO注釋和Pathway富集分析表明，這些蛋白主要是與糖代謝、氧氣運輸、應(yīng)激反應(yīng)、細胞骨架以及氧化還原代謝等生物過程或功能相關(guān)。輔助出殼組糖酵解通路中的4種酶（ALDOB、G3P1、PGK和ENO）和細胞呼吸通路中的3種酶(ACOC、CYC和NDUA4)表達均顯著上調(diào);參與氧氣運輸?shù)?種血紅蛋白（HBAD、HBA和HBE）和應(yīng)激保護的3種熱休克蛋白（HSP60、

9、HSP10和GRP78）表達均顯著下調(diào)。利用qPCR檢測ACO1、ALDOB、G3P1和SPA8基因在mRNA水平的表達，結(jié)果表明在輔助出殼鴨肝臟中，ACO1mRNA的表達顯著上調(diào)(P＜0.05)，ALDOB、G3P1和HSPA8mRNA的表達顯著下調(diào)（P＜0.05），部分基因的mRNA與蛋白質(zhì)的表達模式不一致。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，HSPD1、G3P1、PGK1是最核心的蛋白，提示它們在鴨胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　本研