十字花科黑腐病菌中一個I型S-腺苷甲硫氨酸核開關的鑒定.pdf

1、核開關（Riboswitch）是一段具有調控功能的RNA序列;它通常位于mRNA分子的5'非翻譯區(qū)(5' untranslated regions，5' UTR)，可以不依賴任何蛋白的參與，通過與小分子物質的直接結合來調控該mRNA的轉錄或/和翻譯。核開關是近10年才發(fā)現(xiàn)的一種全新的基因表達調控機制。盡管在植物、真菌和古細菌中也存在核開關，但目前已鑒定的大多數(shù)核開關都存在于細菌中。迄今為止，人們已經(jīng)在大腸桿菌（Escherichia c

2、oli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等生物中鑒定了硫胺素焦磷酸核開關(Thiamine pyrophosphate Riboswitch，TPP Riboswitch)、黃素單核苷酸核開關(Flavin mononucleotide Riboswitch，F(xiàn)MN Riboswitch)、S-腺苷甲硫氨酸核開關（S-adenosyl methionine Riboswitch，SAM Riboswitch）等19種

3、核開關;它們在調控維生素、氨基酸、核苷酸和輔酶合成等基礎代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用。盡管目前核開關存在的廣泛性和功能的重要性已經(jīng)逐步得到確認，但是，在包括十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，簡稱Xcc)在內(nèi)的植物病原細菌中，有功能的核開關尚未見報道。
　　 S-腺苷甲硫氨酸核開關（以下簡稱SAM核開關）通常位于細菌編碼甲硫氨酸(Methionine)或半胱氨酸(Cyst

4、eine)生物合成途徑的關鍵酶的mRNA的5'非翻譯區(qū)，它通過與細胞中S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)的結合來調控這些酶的表達。目前已經(jīng)在枯草芽孢桿菌、遍在遠洋桿菌（Candidatus Pelagibacter ubique）、放線菌(Actinomycetes)等細菌中鑒定了5種類型SAM核開關（SAM-I至SAM-V核開關）;它們在調控細胞的甲硫氨酸生物合成中起關鍵作用。之前，本實驗室通過RN

5、A測序發(fā)現(xiàn)，十字花科黑腐病菌8004菌株(Xcc8004)XC1251基因的起始密碼子前(72bp至192 bp)存在一段與SAM-I核開關序列同源的序列（命名為SAM-IXcc）。本研究對SAM-IXcc是否是一個真正具有調控功能的核開關進行了鑒定。
　　 根據(jù)Xcc8004基因組測序及基因注釋結果，SAM-IXcc下游是三個緊密相鄰且轉錄方向相同的編碼細菌中甲硫氨酸合成途徑關鍵酶的基因:XC1251編碼高絲氨酸O-乙酰轉移酶

6、(Homoserine O-acetyltransferase)，XC1252編碼合胱硫醚-γ-合酶(Cystathionine gamma-synthase)，XC1253編碼高絲氨酸脫氫酶(Homoserine dehydrogenase)。RT-PCR結果證明，XC1251、XC1252、XC1253共轉錄，因此XC1251-XC1252-XC1253是一個轉錄單位。5'-RACE結果顯示，XC1251-XC1252-XC1253

7、的轉錄起始位點位于XC1251基因的起始密碼子ATG前190 bp處，證明SAM-IXcc位于XC1251-XC1252-XC1253轉錄子的5' UTR內(nèi)，符合作為核開關的基本條件。對XC1251、XC1252和XC1253的突變體在基本培養(yǎng)基中的生長檢測結果顯示，這三個基因的突變體均為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型，證明它們的編碼產(chǎn)物確實在Xcc甲硫氨酸生物合成途徑中起關鍵作用。這一結果預示，和其他SAM-I核開關一樣，SAM-IXcc在調控X

8、cc甲硫氨酸生物合成中發(fā)揮作用。對XC1251-XC1252-XC1253轉錄單位的gusA轉錄融合報告菌株003H02的GUS活性檢測結果顯示，XC1251-XC1252-XC1253的轉錄受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的特異性抑制。為了證明XC1251-XC1252-XC1253的轉錄受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的抑制不是通過XC1251-XC1252-XC1253啟動子的作用，本研究將XC1251-XC1252-XC1253的5'

9、UTR區(qū)連接在帶有SD序列的gusA基因的編碼序列前面，然后再連接到表達載體pLARF3的Lac啟動子后面，獲得gusA翻譯融合報告質粒，將其導入Xcc8004后獲得gus報告菌株。GUS活性檢測結果顯示，報告菌株的GUS活性受甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的強烈抑制。由于Lac啟動子在Xcc中是組成型啟動子，因此，感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表達的順式作用元件必定存在于XC1251-XC1252-XC1253的5' UTR

10、序列中。由于在構建的gusA翻譯融合報告質粒中，連接在gusA基因前面的序列除了SAM-IXcc核開關外，還有其他序列，為了證明感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表達的順式作用元件是SAM-IXcc，本研究將報告質粒中SAM-IXcc核開關可能的感受（結合）S-腺苷甲硫氨酸的核苷酸進行了定點突變。GUS活性檢測結果顯示，攜帶SAM-IXcc核開關點突變報告質粒的Xcc8004菌株在添加甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基中檢測到的GUS活性比

11、攜帶野生型SAM-IXcc核開關報告質粒的菌株的GUS活性顯著增強。說明SAM-IXcc突變導致其對甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的響應遲鈍，證明報告質粒中感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表達的順式作用元件就是SAM-IXcc核開關。
　　 總之，以上結果證明:存在于Xcc8004基因組XC1251基因的起始密碼子前72 bp至192 bp處的一段與SAM-I核開關同源的序列，SAM-IXcc，是一個具有調控功能的(Ⅰ)

12、型SAM核開關。它通過感受細胞中S-腺苷甲硫氨酸濃度來調節(jié)甲硫氨酸合成途徑關鍵酶基因的表達，從而達到對細胞甲硫氨酸合成途徑的調控。據(jù)悉，這是植物病原細菌中第一個被證實的有調控功能的核開關。
　　 此外，本研究結果還預示， SAM-Xcc核開關調控XC1251-XC1252-XC1253轉錄的機制與目前已知的SAM-I核開關的調控機制有所不同。但是，SAM-IXcc核開關調控XC1251-XC1252-XC1253轉錄的確切機制還