家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin5多克隆抗體制備及組織表達分析.pdf

1、本研究以家蠶大造為材料，以脂肪體cDNA為模板克隆了家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-5基因，并進行了序列分析。構建了原核表達載體，獲得了重組的目的蛋白，以純化后的目的蛋白為抗原免疫昆明小鼠，制備了Serpin-5蛋白的多克隆抗體。采用此抗體分析了serpin-5在正常5齡3天的家蠶中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管、精巢、卵巢，蛋白水平的組織表達。對家蠶BmN細胞和5齡3天家蠶進行了RNAi研究，采用熒光定量PCR測定了干擾后目的基因在家蠶

2、幼蟲多個組織不同時段的轉錄水平。主要研究結果如下：
　　1.以反轉錄的家蠶5齡幼蟲脂肪體cDNA為模板，PCR擴增獲得了Bmserpin-5基因序列。測序分析表明，克隆的目的基因serpin-5長度為1140bp，編碼379個氨基酸殘基。預測蛋白質分子質量為42.6kDa，等電點為6.02。目的基因（GeneBank登錄號：AY566165）是開放閱讀框（ORF)去除信號肽的片段。用Signal P3.0 Server分析Bmse

3、rpin-5，推測其第1到第16個氨基酸殘基為信號肽序列。
　　2.將目的基因連接到原核表達載體pET-28a(+)上，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經1mmol/L IPTG誘導蛋白表達。重組菌液經超聲波破碎、離心后獲得上清和沉淀，以誘導的空載體菌和未誘導的重組菌作為對照，進行SDS-PAGE檢測。結果表明：在誘導的轉化去除信號肽的pET28a-serpin-5，超聲裂解后的沉淀中出現了一條約為43kDa特異性的蛋白條帶，

4、預測的成熟BmSerpin-5蛋白分子量約為42.6kDa，而超聲裂解后的上清中沒有出現特異性的條帶，表明去信號肽Bmserpin-5基因在大腸桿菌中得到成功表達并多以包涵體的形式存在。
　　3.誘導獲得大量的重組蛋白，采用鎳柱純化回收，獲得目的蛋白，以此為抗原免疫昆明小鼠，Western blot檢測制備的多克隆抗體具有較高的特異性，ELISA檢測該多抗對免疫抗原的效價達到1∶24000，特異性較好。
　　4.在制備高效價

5、抗體的基礎上，采用Western blot法檢測了BmSerpin-5蛋白在多個組織中的表達，結果表明在5齡第3天幼蟲精巢、卵巢中的表達量較高，中腸次之，在絲腺、馬氏管、脂肪體中的表達量較低。BmSerpin-5蛋白在生殖腺中的高表達，推測與家蠶的生殖生理相關。
　　5.在家蠶卵巢細胞BmN中對設計的siRNA片段進行篩選，獲得干擾效果顯著的有效片段。有效片段轉染家蠶五齡第三天幼蟲后，用熒光定量PCR的方法測定精巢、卵巢、絲腺、脂

6、肪體、血液、表皮、馬氏管在24h，36h，48h后的轉錄表達特征。結果表明：與對照相比，在精巢、絲腺、脂肪體中mRNA的轉錄水平無明顯變化；在血液、表皮中48h時都降低了約3倍，卵巢中降低了約4倍，馬氏管中降低的最多，約9倍。干擾后測定血液中酚氧化酶的活性，發(fā)現酶的活性隨時間的延長而逐漸升高，48h時升高了約1.5倍。干擾后，血液中的Bmserpin-5降低了3倍，酚氧化酶活性升高了1.5倍，推測Bmserpin-5與血液中的酚氧化酶存