羅非魚(yú)Lysozyme-C3基因在斑馬魚(yú)中的轉(zhuǎn)植研究.pdf

1、羅非魚(yú)隸屬于鱸形目(Percifomes)、麗魚(yú)科(Cichlidae)、羅非魚(yú)屬(Tilapia),是我國(guó)重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一。近年廣東、海南、福建和廣西等地區(qū)養(yǎng)殖羅非魚(yú)爆發(fā)鏈球病,使我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展受到了嚴(yán)重威脅,因此提高羅非魚(yú)的抗病能力成為迫切需要解決的問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為魚(yú)類(lèi)育種開(kāi)辟了新的途徑。本研究通過(guò)比較、篩選出對(duì)無(wú)乳鏈球菌具有較強(qiáng)溶菌作用的羅非魚(yú)Lysozyme-C3基因,利用本實(shí)驗(yàn)室已分離到的誘導(dǎo)型羅非魚(yú)Hsp70基

2、因啟動(dòng)子,構(gòu)建了羅非魚(yú)Lysozyme-C3基因表達(dá)載體并進(jìn)行顯微注射,觀察轉(zhuǎn)植基因在斑馬魚(yú)中的表達(dá)情況,為轉(zhuǎn)基因培育抗病羅非魚(yú)的研究奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.幾種魚(yú)蝦溶菌酶重組蛋白溶菌活性的比較。采用基因工程重組技術(shù)制備了羅非魚(yú)3種C型溶菌酶的重組蛋白,并應(yīng)用比濁法比較了它們與草魚(yú)C型、G型溶菌酶、斑節(jié)對(duì)蝦C型溶菌酶重組蛋白對(duì)無(wú)乳鏈球菌、嗜水氣單胞菌等8種細(xì)菌的溶菌作用。結(jié)果顯示6種重組溶菌酶對(duì)8種菌均具有溶菌活性,

3、但是溶菌活力強(qiáng)弱不一。羅非魚(yú)C3溶菌酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)乳鏈球菌的溶菌作用最強(qiáng),草魚(yú)C型與G型溶菌酶次之;所有重組溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌均具較強(qiáng)的溶菌活性。與斑節(jié)對(duì)蝦C型溶菌酶、草魚(yú)C型與G型溶菌酶相比,羅非魚(yú)的C型溶菌酶對(duì)嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)的溶菌作用,且以C1的溶菌活性最強(qiáng)。
　　2.應(yīng)用金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)進(jìn)行Lysozyme-C3基因的轉(zhuǎn)植研究。金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子是近年在金魚(yú)上發(fā)現(xiàn)的具有轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子。本實(shí)驗(yàn)室

4、前期研究中,構(gòu)建了帶羅非魚(yú)Hsp70啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒 pTgf2-Hsp70-eGFP并證實(shí)該啟動(dòng)子具有強(qiáng)誘導(dǎo)活性。本實(shí)驗(yàn)利用高保真酶PCR擴(kuò)增羅非魚(yú)Lysozyme-C3基因開(kāi)放閱讀框并替換該供體質(zhì)粒中的eGFP基因,獲得pTgf2-Hsp70-C3表達(dá)載體。然后設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增此載體上的Hsp70-C3-SV40片段,并將其插入 pTgf2-Hsp70-eGFP載體的eGFP之后,從而成功構(gòu)建了用于斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因的雙基因表達(dá)載體pT

5、gf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3。
　　3.轉(zhuǎn)Lysozyme-C3基因斑馬魚(yú)的獲得與檢測(cè)。采用顯微注射方法將攜帶Hsp70啟動(dòng)子、eGFP基因和C3基因的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3和編碼轉(zhuǎn)座酶的mRNA共注射到斑馬魚(yú)的受精卵中。注射12h后37℃熱激處理1h,28℃孵育,12h后使用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況,并挑選出呈綠色熒光的斑馬魚(yú)陽(yáng)性個(gè)體。共有580個(gè)胚胎孵化出

6、膜,其中有261個(gè)胚胎有綠色熒光,熒光率達(dá)45％。采用RT-PCR在轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)F1代肝臟、肌肉、腸道、皮膚中均可檢測(cè)到eGFP基因mRNA,但僅在肝臟中檢測(cè)到Lysozyme-C3基因mRNA。采用 Western blot技術(shù)在轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú) F1代肝臟中均可檢測(cè)到 eGFP和Lysozyme-C3蛋白條帶。分析結(jié)果說(shuō)明,在RNA水平和蛋白水平均能檢測(cè)到轉(zhuǎn)植基因的表達(dá),證實(shí)轉(zhuǎn)植的羅非魚(yú)溶菌酶基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因首代遺傳到 F1代。進(jìn)一步比較