bmo-miR-1對家蠶幼蟲蛻皮的調控.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類大小約為22nt左右的小RNA分子，它們通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄，并經過Drosha和Dicer酶切割形成成熟體，通過轉錄后抑制靶基因的表達來實現其調控作用。迄今為止，已有20000多條miRNA被發(fā)現，它們廣泛涉及到生物體幾乎所有的生理活動中。近年來，家蠶miRNA的研究也正在逐步開展，多國科學家共鑒定了562個家蠶成熟體miRNA，并通過微陣列芯片、深度測序等技術對家蠶miRNA的時空表達情況進行了

2、調查，這就為進一步的功能研究奠定了良好的基礎。
　　 MiR-l是一種進化上較為保守的miRNA，其他物種中的相關研究表明，miR-l主要參與肌組織的發(fā)育和增殖分化、離子通道的調控、腫瘤的抑制以及病毒的復制等生理過程。家蠶中也存在有miR-l，其成熟體序列長度為22nt，主要在頭、體壁等組織中表達。那么在家蠶中，miR-l究竟有什么樣的生物學功能?它的靶基因有哪些?為了回答這兩個問題，我們設計了以下的研究方案：通過miR-l模擬

3、物上調家蠶體內miR-l的水平，觀察可能出現的異常表型；通過基因芯片技術調查注射miR-l模擬物的家蠶基因的差異表達；預測家蠶miR-l的靶基因，結合芯片數據尋找可能的靶基因；通過mRNA水平和蛋白水平檢測，以及雙熒光素酶報告系統(tǒng)來驗證miR-l的靶基因。通過該方案，獲得的主要研究結果如下：
　　 (1)上調Bmo-miR-l導致家蠶蛻皮障礙
　　 家蠶幼蟲吐完絲后身體縮短成為預蛹，經過2到3天蛹皮形成并蛻皮形成蛹。在預

4、蛹期注射miR-l模擬物的家蠶不能蛻去舊表皮，透過半透明的的舊表皮可以看到內部蛹內表皮的形成受到的影響不是很大。剝開舊表皮可以發(fā)現內部是一個變形的蛹，由于頭胸部舊表皮束縛的原因在蛹頭胸部有一明顯的縊痕，并且翅殘缺不全。新舊表皮間有少量液體存在，液體中可能含有多種酶類，可以造成蛹表皮的損壞。人工剝開外表皮的蛹仍可以存活若干天，但在化蛾前死亡。推測可能是由于蛹表皮不完整導致水分喪失過快而造成。
　　 (2)Bmo-miR-l mim

5、ics引起大量基因差異表達
　　 家蠶蛻皮是由多個生化和生理過程組成，必然要涉及到成百上千基因的協(xié)同作用。微陣列芯片檢測發(fā)現，共有1450個基因被檢測到差異表達，包括814個上調基因和636個下調基因。GO分類結果表明，其中有614個基因具有1條以上的GO注釋，總共涉及到19個GO二級分類，細胞過程、生理過程、催化活性和代謝為4個最為富集的GO類目，說明大量涉及到基礎代謝和生理過程的基因受到影響。進一步分析，發(fā)現結構分子活性、免

6、疫系統(tǒng)進程、胞外區(qū)域等類目下差異基因較為富集，而生長、遷移類目下只有下調基因，說明家蠶的生長和表皮結構的形成維持受到了影響。同時，表皮的受損導致體表屏障出現缺陷，從而誘發(fā)免疫系統(tǒng)的激活。對255個表皮蛋白的差異表達分析發(fā)現，有132個表皮蛋白檢測到有表達，其中與幾丁質結合有關的RR-1和RR-2家族分別有85％和75％的成員下調表達，而與幾丁質無關的CPG、Tweedle和CPFL家族均無明顯下調。CPH家族結構和功能較為多樣，其家族成

7、員上下調基因數目也較為接近。由此可以猜測蛻皮異常表型產生的原因可能部分歸結為表皮蛋白基因表達模式的改變所導致的幾丁質-表皮蛋白相互作用的異常。
　　 (3)下調基因中包括部分預測的bmo-miR-l靶基因
　　 靶基因的預測是miRNA功能研究必不可少的環(huán)節(jié)。通過對已有的家蠶3’UTR數據庫進行預測，得到87個潛在bmo-miR-l靶基因，很多靶基因在家蠶和其他物種間存在保守性，比如vATPase家族兩個成員(BmATP

8、6v0c1和BmATP6v0d1)和膠轉蛋白TAGLN。結合基因差異表達數據，我們發(fā)現有18個潛在的靶基因轉錄水平下調。其中就包括上述3個保守的bmo-miR-l靶基因。發(fā)現家蠶幾丁質酶基因BmChi既是bmo-miR-l潛在的靶基因又有5倍左右的下調，我們推測該基因可能受到bmo-miR-l的抑制。
　　 (4)家蠶幾丁質酶基因BmChi是bmo-miR-l的靶基因
　　 為了進一步研究BmChi和家蠶miR-l的關系

9、，我們原核表達了BmCHI，純化并制備多克隆抗體。芯片數據、半定量RT-PCR和western blot從mRNA和蛋白水平上都證實了注射bmo-miR-l的家蠶中BmChi的表達受到明顯抑制。我們又構建了雙熒光素酶報告載體，檢測并發(fā)現bmo-miR-l可以通過BmChi3’UTR來影響報告基因的表達。在潛在的靶位點中，位于356位的靶位點1對miRNA介導的抑制作用貢獻較小。這幾方面的證據共同說明了BmChi是bmo-miR-l的靶基

10、因。
　　 (5)BmChi在家蠶蛻皮過程起重要作用
　　 通過多個昆蟲之間的同源比對和系統(tǒng)進化分析，我們預測了八個家蠶GH18家族幾丁質酶基因，分別為BmChi、BmChiR1、BmCHT2、BmCHT6、BmCHT6b、BmCHT11、BmIDGF和BmCHT12，在編碼蛋白的結構上每個基因都有其特點。根據其他物種中同源基因功能推測，這些基因可能和家蠶的蛻皮、羽化、圍食膜的降解等有關。BmChi的時期表達譜顯示，Bm