擬南芥IKU2互作蛋白鑒定及同源四倍體分析.pdf

1、種子是植物最重要的生殖器官，對植物的生長繁衍至關重要。作為營養(yǎng)物質的儲藏器官，種子也是大多數作物的最終收獲目標，為人類的日常生活和生產提供食物、飼料、以及原材料，在人類的生存和發(fā)展中有著不可替代的作用。近年來通過突變體分析和高通量表達譜分析等方法已經克隆了許多與種子形成和發(fā)育相關的基因，但對于這些基因之間的調節(jié)網絡還有待深入研究。多倍體在高等植物中普遍存在，許多重要農作物都是多倍體。多倍體在促進營養(yǎng)體、種子和果實產量方面有重要作用，其研

2、究一直受到研究者的高度重視。但目前關于同源多倍體表型、基因表達以及生理變化的機制還沒有深入的研究。本研究分為兩個主要部分，第一部分工作是利用酵母雙雜交技術鑒定控制種子大小的HAIKU2(IKU2)的互作蛋白，并利用轉基因技術分析IKU2等基因的功能，第二部分工作是對新獲得的一個同源四倍體擬南芥進行分析，為同源四倍體表型變化的可能機制提供了新信息，主要結果如下：
　　 1、采用SMART擴增技術構建了一個高質量的擬南芥0-3 d角

3、果cDNA文庫。IKU2被預測為富畬亮氨酸的受體激酶(LRR-RLK)，以IKU2蛋白的胞外域篩到一個候選蛋白AJH1；以胞內域為誘餌篩到27個候選基因。通過濾紙印跡染色(X-Gal)、重新Mating雜交和共轉化等方法，驗證了挑選的候選基因與對應的誘餌蛋白互作的真實性，但是它們都不能與IKU2全長蛋白發(fā)生相互作用。
　　 2、從ABRC購買了19個基因的29個突變體，共篩選得到13個基因的18個陽性純合體，但這些材料的種子大小

4、均與野生型沒有顯著的差別。構建IKU2-OE、IKU2反義、IKU2-GFP、IKU2BN-GFP(胞內結構域)、IKU2BW-GFP(胞外結構域)以及ORG4-OE、ORG4反義、YFP-ORG4、ORG4-GFP、ORG4-RNAi等載體，并都轉化了擬南芥。通過半定量PCR分析挑選的轉基因材料都獲得了相應的目的單株；但檢測各融合蛋白的熒光信號，只有IKU2BN-GFP被檢測到。
　　 3、對各載體轉基因家系的粒重分析沒有得到

5、穩(wěn)定一致的變異，但從IKU2反義轉化材料中發(fā)現(xiàn)一個植株，其植株和種子均增大。我們將此株系命名為Big seedling(Bs)，后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)BS為一個同源四倍體材料。
　　 4、同源四倍體擬南芥(BS)能夠產生與二倍體(WT)顯著不同的表現(xiàn)型，主要體現(xiàn)在葉片、主莖、花、角果和種子等器官增大，生長發(fā)育延緩等。通過掃描電鏡觀察成熟種子，以及通過微分干涉顯微鏡觀察萌發(fā)后4-11 d的子葉，發(fā)現(xiàn)BS子葉增大主要是由于細胞體積增大而不是細

6、胞數目增多造成的。
　　 5、BS的胚發(fā)育比WT慢約1d，但相同發(fā)育階段BS的胚均比WT大；BS每一粒種子中可溶性蛋白質、脂肪酸、可溶性糖以及淀粉的含量分別比WT多約64%，45%，57%和55%；但各物質的質量分數沒有發(fā)生變化。對8個粒重相關基因和34個細胞周期基因進行表達分析發(fā)現(xiàn)，ICK1、ICK2和ICK5在BS蓮座葉和花器官中穩(wěn)定地上調表達1.5-2倍，而其它基因的表達變化在BS和WT中差異不顯著。
　　 6、應

7、用植物激素、葡萄糖、甘露醇和NaCl等多種物質處理BS和WT幼苗，發(fā)現(xiàn)BS對單一的植物激素處理與WT沒有差異，而對葡萄糖處理比WT顯著敏感。通過甘露醇和NaCl對照實驗發(fā)現(xiàn)BS對葡萄糖敏感不是由于滲透脅迫造成的，因為BS比WT更加耐受NaCl脅迫，對甘露醇處理與WT沒有差別。通過與另一個同源四倍體4COL對照發(fā)現(xiàn)四倍體對葡萄糖敏感具有普遍性。
　　 7、對葡萄糖處理下BS，4COL和WT第3片真葉以及根表皮細胞大小和數目進行考察

8、發(fā)現(xiàn)，與對照培養(yǎng)基相比，葡萄糖處理下四倍體的細胞大小和細胞數目受到顯著的抑制，而二倍體受到的影響較小。
　　 8、通過流式細胞檢測葡萄糖和甘露醇處理10 d后BS、4COL以及WT幼苗真葉的倍性水平(細胞核內復制)的變化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖處理后細胞倍性降低而甘露醇處理后細胞倍性升高，這種變化趨勢在四倍體和二倍體中是相同的。
　　 9、對葡萄糖處理后四倍體和二倍體的基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)與對照培養(yǎng)基相比，CYCD、CYCB以及I