微流控LAMP芯片的研究及在生物分子床邊快速檢測中的應用.pdf

1、本論文工作創(chuàng)造性地結合環(huán)介導等溫核酸擴增和微流控芯片技術，以特異保守基因分子標簽為檢測對象，建立了單重、多重、定性、定量和集成LAMP微流控芯片，并成功應用于豬偽狂犬病毒，甲型流感病毒和肺結核桿菌等重大傳染性病原體的快速診斷和分型。
　　 本論文工作利用同源分析軟件Vector NTI，借助美國基因數據庫Genbank，搜尋得到豬偽狂犬病毒(DNA結合蛋白基因)，甲型流感病毒(紅細胞凝素酶編碼基因)和肺結核桿菌(GyrB蛋白編碼

2、基因)的特異性基因分子標簽；利用PrimerExplorer V3軟件成功設計各分子標簽的LAMP探針；通過單因素試驗確立了最佳LAMP反應體系；通過微機電加工技術和軟光刻技術制作各種LAMP微芯片模塊。
　　 1)單重定性/定量LAMP微芯片的反應槽長10 mm，寬0.6 mm，深0.8 mm，容納體積約5μL，利用PDMS材料的生物友好性、材質氣密性和高透光性成功實現了LAMP擴增和結果直接肉眼判定。通過整合穿透式微型光纖，

3、實時監(jiān)測芯片LAMP反應陽性信號產生時間點，制作標準曲線，定量目標物含量。該芯片成功應用于豬偽狂犬病毒的快速檢測，一次進樣僅0.4μL，可在1小時內高特異檢出10龜的目標物量，定量線性曲線的R2值達到0.9894。
　　 2)多重定性/定量LAMP微芯片具有多個發(fā)散式擴增池，通過連接管道與擴散限制毛細通道相連，中間為加樣孔，利用微小結構通道中流體的低傳質系數特性，杜絕了不同擴增池中信號的混串，實現了信號多重判定，通過整合反射式微

4、型光纖，準確定量樣品中目標核酸量。該芯片成功應用于季節(jié)性流感病毒、豬源性流感病毒和普通甲型流感病毒的一步快速分型，進樣僅4μL，可在45 mln至60 min內高特異區(qū)分出被檢樣品中流感病毒的類型，檢測靈敏度可達10個拷貝以下，定量線性曲線的相關系數R2值達到分別為0.9897、0.9962和0.9984。
　　 3)單重/多重集成LAMP微芯片由DNA提取室、LAMP擴增室和螺絲微閥組成，利用PDMS材料的彈性特質和螺絲微閥驅

5、動和控制流體，成功地整合了核酸提取、擴增和信號檢測，實現了sample-to-answer的診斷效果。該芯片成功應用于肺結核桿菌等細菌的快速診斷，僅需約10μL原始樣品量，可以在45 min至60 min內通過肉眼快速判定樣品中是否含有肺結核桿菌或分型多種細菌性病原體。以上三種模式LAMP微芯片操作簡便、價格低廉、樣品用量少、分析速度快且不依賴昂貴儀器，非常適合于床邊分子快速檢測和分析。該芯片體系可以擴展到其它任意病原體的床邊快速檢測，