轉(zhuǎn)基因作物檢測陽性質(zhì)粒分子的研制及應用.pdf

1、隨著我國轉(zhuǎn)基因技術的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的不斷擴大,轉(zhuǎn)基因作物的種類和數(shù)量不斷增加,轉(zhuǎn)基因作物安全管理的任務將越來越繁重,尤其是非法釋放到環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品時有發(fā)生,試驗階段轉(zhuǎn)基因生物的安全監(jiān)管工作將是我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理的重點和難點。在試驗階段轉(zhuǎn)基因作物陽性樣品非常有限的情況下,如何根據(jù)轉(zhuǎn)基因作物本身的遺傳信息研發(fā)出容易獲取的、可大量生產(chǎn)的標準物質(zhì),以滿足轉(zhuǎn)基因作物安全監(jiān)管工作的需求至關重要,轉(zhuǎn)基因作物檢測陽性質(zhì)粒分子是滿

2、足我國當前需要的最優(yōu)選擇。
　　本研究以處于試驗階段、尚未進入商業(yè)化應用、亟需研制標準物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因作物為研究對象,建立相應的檢測方法并制備適合這類作物的陽性質(zhì)粒分子,來解決因無法大量獲得這些轉(zhuǎn)基因品種的基體陽性物質(zhì)而難以進行轉(zhuǎn)基因檢測、監(jiān)測的難題。本研究取得的創(chuàng)新結果有以下幾個方面:
　　1、建立4個檢測方法。
　　根據(jù)耐除草劑G2-aroA基因、真菌來源的植酸酶基因序列、轉(zhuǎn)基因水稻T1c-19和T2A-15'端的轉(zhuǎn)化

3、體序列信息,通過引物設計與優(yōu)化,Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度梯度優(yōu)化,建立了G2-aroA基因和植酸酶基因,T1c-19和T2A-1事件特異性檢測方法。結果表明檢測方法均具有良好的特異性和靈敏度,靈敏度均能夠達到0.1％,可以滿足我國轉(zhuǎn)基因成分定性檢測對靈敏度的要求。
　　2、構建了適用于6大作物(水稻、玉米、大豆、棉花、小麥和油菜)篩查用的內(nèi)標準基因陽性質(zhì)粒分子pBS Endogenous。
　　根據(jù)國家標準中玉米內(nèi)標

4、基因zSSIIb、油菜內(nèi)標基因HMG I/Y、小麥內(nèi)標基因waxy-D1、水稻內(nèi)標基因SPS、棉花內(nèi)標基因Sad1和大豆內(nèi)標準基因Lectin序列信息,構建了內(nèi)標準基因特異性檢測陽性質(zhì)粒分子pBS Endogenous,實驗結果表明,該質(zhì)粒具有較好的特異性和檢測靈敏度,能夠用于內(nèi)標準基因擴增的陽性對照。
　　3、構建了7種基因特異性篩查檢測的陽性質(zhì)粒分子pBar、pPAT、pEPSPS(Mo)、pEPSPS(Na)、pG2-aro

5、A、pCry1Ab/1Ac、pPhytase。
　　將轉(zhuǎn)基因檢測中常用的篩查基因Bar、PAT、CP4-EPSPS(天然的)、CP4-EPSPS(修飾的)、G2-aroA、Cry1Ab/1Ac、Phytase克隆至質(zhì)粒載體中,研制了7種基因特異性陽性質(zhì)粒分子,實驗結果表明這些質(zhì)粒分子均具有很強的基因特異性,適合用于轉(zhuǎn)基因作物中的基因鑒別。定性PCR檢測靈敏度均能達到50拷貝μL-1,其中pG2-aroA檢測極限能夠達到10拷貝μL

6、-1。
　　4、研制了四種轉(zhuǎn)基因作物(水稻、棉花、玉米、大豆)的12種轉(zhuǎn)化事件特異性陽性質(zhì)粒分子和2種構建特異性陽性質(zhì)粒分子(pCV127-G和pBVLA430101-G)。其中pKF6、pM12、pT1c-19、pT2A-1、pKMD分別用于轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號、M12、T1c-19、T2A-1和克螟稻1號的檢測;pEZM1、pNN98-7分別用于鄂雜棉1號、南農(nóng)98-7的檢測;pA2704-12、pA5547-127、pCV12

7、7-Z分別用于轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、A5547-127、CV127的檢測;pBVLA430101-Z、pMIR162分別用于轉(zhuǎn)植酸酶玉米 BVLA43010和MIR162的檢測。實驗表明這些質(zhì)粒分子在定性PCR檢測過程中,檢測極限均能達到50拷貝μL-1,其中pM12、pEZM1、pMIR162、pCV127-G檢測極限能夠達到10拷貝μL-1。
　　5、組織10家國內(nèi)具有資質(zhì)的檢測機構對所構建的4個檢測方法和研制的22種陽