基于茶樹(shù)基因組測(cè)序信息的UGTs基因的分析、克隆與原核表達(dá)研究.pdf

1、茶樹(shù)中許多與品質(zhì)相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物是以糖苷形式存在的。UDPG依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是催化糖苷形成的酶類。類黃酮合成途徑中存在一些相關(guān)的UGTs酶，促進(jìn)黃酮醇、花青素、兒茶素和酚酸的糖苷化反應(yīng)。研究這些基因及其功能，對(duì)茶樹(shù)良種選育、茶葉品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。木實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)手段、RACE技術(shù)、原核表達(dá)方法、RT-PCR技術(shù)，對(duì)茶樹(shù)中的UGTs基因進(jìn)行分類、命名和克隆及表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)利用生物

2、信息學(xué)手段，從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選UGTs基因。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，對(duì)茶樹(shù)68條CsUGTs基因進(jìn)行分類，并依據(jù)擬南芥的分類方法，將茶樹(shù)68條CsUGTs分為12組。利用國(guó)際通行的系統(tǒng)命名法，分別對(duì)68條CsUGTs進(jìn)行系統(tǒng)命名。
　　 2.利用同源克隆法，對(duì)CsUGT73E1、CsUGT78E1、CsUGT72F1進(jìn)行cDNA克隆。3個(gè)基因編碼的氨基酸序列數(shù)分別為475、459和465；預(yù)測(cè)蛋白的分子量為53.72、49.48和

3、50.57kDa；等電點(diǎn)為5.62、5.96和5.71。信號(hào)肽分析表明3個(gè)基因均不含有信號(hào)肽。
　　 3.CsUGT78E1基因編碼的氨基酸序列與已知葡萄VvGT1(accessionnumber：P51094.2，PDBid：2c9z)最相似，一致性為59％，相似性為75％，符合同源建模條件。依據(jù)葡萄VvGT1的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)CsUGT78E1進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)其合適的底物。同源建模預(yù)測(cè)CsUGT78E1可能以UDP-葡萄糖及花

4、青素、槲皮素和山奈素為底物形成3-O糖苷。
　　 4.利用構(gòu)建的pET32a-CsUGT73E1、pET32a-CsUGT78E1pET32a-CsUGT72F1、pGEX-4T-2-CsUGT73E1、pET28a-CsUGT78E1和pET28a-CsUGT72F1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，在0.1mmol/LIPTG濃度和不同溫度(37℃、25℃、16℃)誘導(dǎo)下進(jìn)行原核表達(dá)，但是表達(dá)蛋白均以包涵體形式存在

5、。
　　 5.將pET32a-CsUGT78E1包涵體進(jìn)行復(fù)性，并使用親和層析對(duì)復(fù)性后的蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)復(fù)性的pET32a-CsUGT78E1蛋白仍然無(wú)酶活性。
　　 6.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究了CsUGT73E1、CsUGT78E1、CsUGT72F1在茶葉鮮葉不同發(fā)育階段和不同處理的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，CsUGT73E1在芽中表達(dá)量最高，而CsUGT78E1和CsUGT72F1在成熟葉中表達(dá)量最高