雞新城疫抗體檢測試紙條的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、雞新城疫(Newcastledisease，ND)是由副粘病毒科腮腺炎病毒屬的1型副粘病毒（Paramyxovirus）新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的一種極易傳染的毀滅性疾病，該疾病嚴重地阻礙了世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。
　　 檢測雞群的免疫水平和評價雞群的免疫狀況對于該病的控制有著重要的意義。而目前，新城疫抗體檢測技術(shù)主要局限于實驗室檢測，在臨床應(yīng)用時有一定的局限性。本研究利用原核表達血凝素神經(jīng)

2、氨酸酶蛋白，結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，建立了雞新城疫病毒抗體快速檢測方法，取得以下研究結(jié)果：
　　 1.新城疫血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白的原核表達及純化用本實驗室保存的NDVLaSota株通過雞胚傳代，收取尿囊液后提取病毒RNA，分別設(shè)計帶有BamHI和HindⅢ酶切位點的兩對引物，利用RT-PCR擴增出HN基因的全長和去信號肽和跨膜區(qū)序列的片段，將兩種擴增產(chǎn)物分別克隆進pGEX-KG載體，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pKG-HN和pKG-H

3、Nde-sp，測序后，兩條基因大小分別為1734bp和1593bp，擴增序列與GenBank上報道的LaSota株的基因核苷酸序列的同源性為99％。將構(gòu)建好的pKG-HN和pKG-HNde-sp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重組表達的蛋白分子量分別約為89KD和80KD。經(jīng)過對表達蛋白的條件進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，pKG-HNdc-sp在溫度為37℃、IPTG濃度為1‰和誘導(dǎo)5h的表達量

4、最高，Western-Blot分析表明，表達蛋白有較好的免疫學(xué)活性。
　　 2.雞新城疫病毒抗體快速檢測試紙條的建立用檸檬酸三鈉還原法制備20nm的膠體金，用鼠抗雞IgGFc單抗標記，標記的最佳pH為8.0，最佳標記量為9.6μL1.0mg/mL。以金標鼠抗雞IgGFc單抗為探針，以兔抗鼠IgG作為質(zhì)控線，以純化的HN蛋白作為檢測線的捕獲試劑，初步建立了能檢測雞新城疫抗體的膠體金快速檢測試紙條。兔抗鼠IgG的最佳噴膜濃度為1.0

5、mg/mL，HN表達蛋白的最佳噴膜濃度為1.1mg/mL。該試紙條與傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎、禽流感H9亞型、禽流感H5亞型、雞毒霉形體等陽性血清和無特定病原體雞陰性血清反應(yīng)均為陰性；靈敏度與血凝抑制試驗結(jié)果一致。該方法操作簡單，特異性強，靈敏度高，可用于雞新城疫血清抗體水平的檢測。
　　 3.雞新城疫抗體快速檢測試紙條的初步應(yīng)用用本試驗制備的雞新城疫抗體快速檢測試劑盒進行臨床應(yīng)用，檢測240份血清，其中試紙條檢測出陽性血清